DNA敲入系统技术方案

本公开内容涉及一种高效基因组编辑技术。一方面，该技术可显著提高细胞内靶向(包括基因打靶)的同源重组效率。使用该技术，可以快速且高效地产生经遗传修饰的细胞系、大鼠、小鼠、斑马鱼，和其他物种的受精卵。

DNA type system

This disclosure involves an efficient genome editing technique. On the one hand, this technique can significantly improve the homologous recombination efficiency of the intracellular targeting (including gene targeting). Using this technique, the genetically modified cell lines, rats, mice, zebrafish, and the fertilized eggs of other species can be quickly and efficiently real estate.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA敲入系统相关申请本申请要求于2014年8月14日提交的美国临时专利申请号62/037,551的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。ASCII文本文件的序列表的提交以下ASCII文本文件的提交的内容通过引用整体并入本文：计算机可读形式(computerreadableform，CRF)的序列表(文件名：735782000140SeqList.txt，记录日期：2015年8月11日，大小：24KB)。
本专利技术涉及一种高效的DNA敲入(enhancedDNAknock-in，EKI)系统及其用途。
技术介绍
DNA编辑的最新发展允许将外源基因有效引入宿主细胞的染色体中(基因敲入)。这允许将编码蛋白质的cDNA序列插入生物体基因组中的特定基因座，例如，在染色体上的特定基因座处插入突变或外源基因。例如，可通过敲入将点突变引入靶基因中，以模拟人类遗传疾病。此外，可以通过同源重组将外源基因如报告基因(EGFP、mRFP、mCherry、tdTomato等)引入靶基因的特定基因座，并且可以将所述外源基因用于跟踪靶基因的表达并通过报告基因的表达研究其表达谱。在许多情况下，基因敲入涉及生物体内的同源重组机制。在自然条件下，外源靶向载体和细胞基因组之间的同源重组的概率非常低，约为1/105至1/106。自发基因打靶通常在哺乳动物细胞中以非常低的频率发生，其效率为百万个细胞之一。双链断裂的存在经常产生重组，并会将同源重组频率提高几千倍。参见Jasin，1996，“Geneticmanipulationofgenomeswithrare-cuttingendonucleases，”Trendsingenetics：TIG12(6)：224-228。在植物中，已知在DNA中产生双链断裂可将同源重组的频率从约10-3至10-4的背景水平提高约100倍。参见Hanin等，2001，“GenetargetinginArabidopsis，”PlantJ.28：671-77。通过建立鼠胚胎干细胞系使得通过同源重组产生基因修饰的小鼠成为可能。例如，可以使用细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)构建靶向载体，并通过转染(例如电穿孔)将其引入鼠胚胎干细胞。选择阳性胚胎干细胞克隆并将其注射到小鼠囊胚内显微细胞团中，然后植入代孕小鼠以产生遗传工程化的嵌合小鼠。然而，用于建立来自其他物种的胚胎干细胞系的方法尚未得到成功和广泛使用。最近开发的技术，包括ZFN(zincfingernuclease，锌指核酸酶)、TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，转录激活因子样效应物核酸酶)、CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，成簇的规律间隔的短回文重复)/Cas9和其他位点特异性核酸酶技术，使得可能在所需的基因座位点处产生双链DNA断裂。这些受控的双链断裂可以促进在这些特定基因座位点处的同源重组。该过程依赖于用内切核酸酶靶向核酸分子(例如染色体)的特定序列，所述内切核酸酶识别并结合这样的序列并诱导在核酸分子中的双链断裂。双链断裂通过易错的非同源末端连接(nonhomologousend-joining，NHEJ)或通过同源重组(homologousrecombination，HR)修复。在DNA修复期间发生的同源重组倾向于导致非交换型(non-crossover)产物，实际上按照其在双链断裂之前存在的状态修复受损的DNA分子，或通过并入模板的序列产生重组分子。后者已被用于基因打靶、蛋白质工程和基因治疗。如果以反式提供同源重组的模板(例如通过将外源模板引入细胞中)，则可以使用提供的模板来修复细胞中的双链断裂。在基因打靶中，与常规的基于同源重组的基因打靶相比，初始双链断裂使打靶的效率提高几个数量级。原则上，该方法可用于在修复位点插入任何序列，只要其侧翼有适当的区域与靠近双链断裂的序列同源。虽然这种方法已经在多种物种(例如小鼠和大鼠)中成功，但同源重组的效率和成功率仍然较低，这阻碍了该方法被广泛使用。例如，该方法对于科学和商业用途来说仍然是昂贵的和技术上的挑战。本文引用的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容均通过引用整体并入本文。专利技术概述在一个实施方案中，本文公开了在真核细胞中染色体上的预定插入位点处插入供体序列的方法，其包括(a)将在所述插入位点切割所述染色体的序列特异性核酸酶引入所述细胞；(b)将供体构建体引入所述细胞；以及(c)将外切核酸酶引入所述细胞。在一个方面，所述供体构建体是线性核酸或者其在所述细胞内被切割以产生线性核酸。在另一个方面，所述线性核酸包含5’同源臂、所述供体序列和3’同源臂。在某些方面，所述5’同源臂与所述染色体上的核酸酶切割位点上游的序列同源，并且所述3’同源臂与所述染色体上的切割位点下游的序列同源。在一些实施方案中，所述5’同源臂和所述3’同源臂分别邻近所述线性核酸的5’和3’末端。在另一些实施方案中，所述供体序列通过同源重组在所述插入位点处插入所述染色体。在一些实施方案中，本文所使用的序列特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。在一些实施方案中，本文所使用的序列特异性核酸酶是转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，本文所使用的序列特异性核酸酶是RNA引导性核酸酶(RNA-guidednuclease)。在一个方面，所述RNA引导性核酸酶是Cas，例如Cas9。在涉及RNA引导性核酸酶的任何前述实施方案中，所述方法还可以包括将识别所述插入位点的向导RNA(guideRNA，gRNA)引入细胞中。在任何前述实施方案中，可以将所述序列特异性核酸酶作为蛋白质、mRNA或cDNA引入细胞中。在一些实施方案中，所述5’同源臂和所述插入位点5’侧的序列之间的序列同源性为至少约80％。在一些实施方案中，所述3’同源臂和所述插入位点3’侧的序列之间的序列同源性为至少约80％。在任何前述实施方案中，所述5’同源臂和3’同源臂可为至少约200碱基对(bp)。在任何前述实施方案中，所述外切核酸酶是5’至3’外切核酸酶。在一个方面，所述外切核酸酶是1型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype1，HSV-1)外切核酸酶。在一个实施方案中，所述外切核酸酶是UL12。在任何前述实施方案中，供体构建体可以是线性核酸。在一些实施方案中，供体构建体在引入细胞中时是环状的，并在细胞内被切割以产生线性核酸。在一个方面，供体构建体还包含5’同源臂上游的5’侧翼序列和3’同源臂下游的3’侧翼序列。在一个实施方案中，5’侧翼序列或3’侧翼序列为约1至约500bp。在一些实施方案中，本文公开的方法还包括将第二序列特异性核酸酶引入细胞，所述第二序列特异性核酸酶在一个或两个侧翼序列处切割供体构建体，从而产生线性核酸。在某些实施方案中，序列特异性核酸酶是RNA引导性核酸酶，并且该方法还包括将识别侧翼序列之一或两者的第二向导RNA引入细胞。在任何前述实施方案中，真核细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是合子或多能干本文档来自技高网...

【技术保护点】
在真核细胞中染色体上的预定插入位点处插入供体序列的方法，其包括：a)将在所述插入位点切割所述染色体的序列特异性核酸酶引入所述细胞；b)将供体构建体引入所述细胞；以及c)将外切核酸酶引入所述细胞；其中所述供体构建体是线性核酸或者其在所述细胞内被切割以产生线性核酸，其中所述线性核酸包含5’同源臂、所述供体序列和3’同源臂，其中所述5’同源臂与所述染色体上的核酸酶切割位点上游的序列同源，并且其中所述3’同源臂与所述染色体上的核酸酶切割位点下游的序列同源；其中所述5’同源臂和所述3’同源臂分别邻近所述线性核酸的5’和3’末端，并且其中所述供体序列通过同源重组在所述插入位点处插入所述染色体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.14 US 62/037,5511.在真核细胞中染色体上的预定插入位点处插入供体序列的方法，其包括：a)将在所述插入位点切割所述染色体的序列特异性核酸酶引入所述细胞；b)将供体构建体引入所述细胞；以及c)将外切核酸酶引入所述细胞；其中所述供体构建体是线性核酸或者其在所述细胞内被切割以产生线性核酸，其中所述线性核酸包含5’同源臂、所述供体序列和3’同源臂，其中所述5’同源臂与所述染色体上的核酸酶切割位点上游的序列同源，并且其中所述3’同源臂与所述染色体上的核酸酶切割位点下游的序列同源；其中所述5’同源臂和所述3’同源臂分别邻近所述线性核酸的5’和3’末端，并且其中所述供体序列通过同源重组在所述插入位点处插入所述染色体。2.权利要求1所述的方法，其中所述序列特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。3.权利要求1所述的方法，其中所述序列特异性核酸酶是转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。4.权利要求1所述的方法，其中所述序列特异性核酸酶是RNA引导性核酸酶。5.权利要求4所述的方法，其中所述RNA引导性核酸酶是Cas。6.权利要求5所述的方法，其中所述RNA引导性核酸酶是Cas9。7.权利要求4至6中任一项所述的方法，其还包括将识别所述插入位点的向导RNA(gRNA)引入所述细胞。8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述序列特异性核酸酶作为蛋白质、mRNA或cDNA引入所述细胞。9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述5’同源臂和所述插入位点5’侧的序列之间的序列同源性为至少约80％。10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述3’同源臂和所述插入位点3’侧的序列之间的序列同源性为至少约80％。11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述5’同源臂和所述3’同源臂为至少约200bp。12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述外切核酸酶是5’至3’外切核酸酶。13.权利要求12所述的方法，其中所述外切核酸酶是1型单纯疱疹病毒(HSV-1)外切核酸酶。14.权利要求13所述的方法，其中所述外切核酸酶是UL12。15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述供体构建体是线性核酸。16.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述供体构建体在引入所述细胞时是环状的，并且在所述细胞内被切割以产生线性核酸。17.权利要求16所述的方法，其中所述供体构建体还包含所述5’同源臂上游的5’侧翼序列和所述3’同源臂下游的3’侧翼序列。18.权利要求17所述的方法，其中所述5’侧翼序列或所述3’侧翼序列为约1至约500bp。19.权利要求17或18所述的方法，其中所述方法还包括将第二序列特异性核酸酶引入所述细胞，所述第二序列特异性核酸酶在所述侧翼序列之一或两者处切割所述供体构建体，从而产生所述线性核酸。20.权利要求17或18所述的方法，其中所述序列特异性核酸酶是RNA引导性核酸酶，并且其中所述方法还包括将识别所述侧翼序列之一或两者的第二向导RNA引入所述细胞。21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。22.权利要求21所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是合子或多能干细胞。23.产生经遗传修饰的动物的方法，所述动物包含插入所述动物染色体上预定插入位点处的供体序列，所述方法包括：a)将在所述插入位点处切割所述染色体的序列特异性核酸酶引入细胞；b)将供体构建体引入所述细胞；c)将核酸外切酶引入所述细胞；以及d)将所述细胞引入载体动物以产生所述经遗传修饰的动物；其中所述供体构建体是线性核酸或...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11