检测基因组编辑制造技术

提供了用于对基因组编辑进行定量的方法、组合物和试剂盒。在一个方面中，本发明专利技术提供了一种同时对细胞样品中同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物定量的方法，其中所述细胞样品已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点的特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测基因组编辑相关申请的交叉参考本申请要求2015年1月9日提交的美国临时专利申请62/101,828，2015年8月5日提交的美国临时专利申请62/201,446的优先权，这两份申请的内容被纳入本文作为参考。联邦资助的研究与开发下作出专利技术的权利声明本专利技术是在政府支持下由国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的基金号HL100406和HL098179资助完成。政府享有本专利技术的某些权利。序列表提交的引用本申请包括2016年1月8日生成的名为“0968442_ST25.txt”的文本文件的序列表并且含有9,073个字节。该文本文件中含有的内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。专利技术背景生物技术和药学界对基因组编辑的方法和组合物有极大兴趣。事实上，精确编辑基因组的能力被认为是多种治疗应用开发的限速步骤。最近的技术已经拓展了可用于基因组编辑的多个工具。这类工具包括锌指核酸酶(参见，例如，Kim等，ProcNatlAcadSciUSA.1996年2月6日；93(3)：1156-60)；转录激活因子样效应核酸酶(TALENS)(参见，例如，Miller等，NatBiotechnol.2011年2月；29(2)：143-8)；CRISPR-Cas(参见，例如，Mali等，NatMethods.2013年10月；10(10)：957-63)核酸酶；及其缺刻酶形式。
技术实现思路
在一个方面中，本专利技术提供了一种同时对细胞样品中同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物定量的方法，其中所述细胞样品已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点的特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触，或所述细胞样品包含已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触的细胞，所述方法包括：a)形成多个具有平均体积的混合物划分产物(mixturepartitions)，其中混合物划分产物包含：i)靶基因组区；ii)DNA-依赖性DNA聚合酶；iii)正向和反相寡核苷酸扩增引物，其中所述正向和反应引物与靶基因组区的相反链杂交并侧接靶基因组区，并且其中引物设置成在聚合酶存在下扩增靶基因组区；iv)可检测标记的寡核苷酸参考探针，其中参考探针与野生型靶基因组区，含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的同源定向修复引入的HDR突变的靶基因组区，和含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的NHEJ修复引入的NHEJ突变的靶基因组区杂交；v)可检测标记的寡核苷酸HDR探针，其中HDR探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交；并且vi)可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落(drop-off)探针，其中所述NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区杂交，并且其中所述NHEJ脱落探针不与含有NHEJ突变的靶基因组区杂交；b)扩增多个混合物划分产物中的靶基因组区；和c)通过检测多个混合物划分产物中标记的探针与靶基因组区的杂交来确定野生型靶基因组区的量、含有HDR突变的靶基因组区的量、和含有NHEJ突变的靶基因组区的量。在一些实施方式中，细胞样品包含已经与设置成在靶基因组区中切割或切开DNA的位点特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触的细胞。在一些情况中，接触的细胞的至少一部分已被编辑，所述编辑由通过同源定向修复将HDR模板核酸插入位点特异性基因组编辑试剂的切割位点中来进行。在一些实施方式中，细胞样品包含已经与设置成在靶基因组区切割或切开DNA的位点特异性基因组编辑试剂接触(例如，没有与HDR模板核酸接触)的细胞。在一些情况中，已经通过在位点特异性基因组编辑试剂的切割位点处的非同源末端连接修复编辑了接触的细胞的至少一部分。在一些实施方式中，参考和HDR探针包括相同的可检测标记物。在一些实施方式中，HDR探针不与野生型靶基因组区杂交。在一些实施方式中，NHEJ脱落探针不与含有HDR突变的靶基因组区杂交。在一些实施方式中，NHEJ脱落探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交。在一些实施方式中，DNA依赖性DNA聚合酶包含5’至3’外切核酸酶活性和c)包括检测多个混合物划分产物中由对杂交的标记的探针的5’至3’外切核酸酶消化导致的荧光增加。在一些实施方式中，多个混合物划分产物还包括HDR暗寡核苷酸探针，其中HDR暗探针包括不可由DNA聚合酶延伸的3’末端，并且其中HDR暗探针与HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。在一些实施方式中，NHEJ脱落探针与HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。在一些实施方式中，位点特异性基因组编辑试剂是CRISPR-Cas9试剂、TALEN、或锌指核酸酶。在一些实施方式中，位点特异性基因组编辑试剂包括2种位点特异性基因组缺刻酶，其中各缺刻酶设置成在其他缺刻酶的不到约1kb以内切开细胞基因组中的靶DNA。在一些实施方式中，该方法包括，在形成多个混合物划分产物之前，提供已经与位点特异性基因组编辑试剂接触的细胞样品并提取靶基因组区。在一些实施方式中，该方法包括，在形成多个混合物划分产物之前，提供细胞样品并提取靶基因组区。在一些情况中，所述提供包括使多个细胞与位点特异性基因组编辑试剂接触。在一些情况中，向患者给予与位点特异性基因组编辑试剂接触的多个细胞，并且所述提供包括提供来自已经向其给予细胞的患者的细胞样品。在一些情况中，所述提供还包括使多个细胞与HDR模板核酸接触，其中所述HDR模板核酸包含靶基因组区的部分的突变并且设置成在对靶基因组区的同源定向修复期间发挥模板作用，从而将HDR突变引入靶基因组区。在一些情况中，HDR模板核酸包含DNA。在一些情况中，HDR模板核酸是单链DNA寡核苷酸。在一些实施方式中，多个混合物划分产物包含多个结构上不同的可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落探针，其中所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区的不同亚区杂交。在一些情况中，所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交。在一些情况中，其中所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且不与HDR突变的亚区杂交。在一些情况中，其中所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且与含有HDR突变的靶基因组区杂交。在一些实施方式中，c)包括通过对以下进行检测并计数来确定样品中具有NHEJ突变的靶基因组区的浓度：i)不含靶基因组区的混合物划分产物的总数；和ii)以下部分的总数：-其中仅检测到含NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；和-不含靶基因组区的混合物划分产物，其中浓度计算为多个混合物的平均体积的倒数乘以i)除以ii)的比率的负自然对数。在一些实施方式中，c)包括通过对以下进行检测和计数以确定样品中具有HDR突变的靶基因组区的浓度：i)以下的总数：-不含靶基因组区的混合物划分产物；-其中仅检测到含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；-其中仅检测到野生型靶基因组区的混合物划分产物；和-其中仅检测到野生型靶基因组区和含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；并且ii)以下的总数：-i)；和-其中检测到HDR突变的混合物划分产物，其中浓度计算为多个混合物划分产物的平均体积的倒数乘以i)除以ii本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对细胞样品中同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物同时定量的方法，其中所述细胞样品包含已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触的细胞，所述方法包括：a)形成多个具有平均体积的混合物划分产物，其中混合物划分产物包含：i)靶基因组区；ii)DNA‑依赖性DNA聚合酶；iii)正向和反相寡核苷酸扩增引物，其中所述正向和反应引物与靶基因组区的相反链杂交并侧接靶基因组区，并且其中引物设置成在聚合酶存在下扩增靶基因组区；iv)可检测标记的寡核苷酸参考探针，其中参考探针杂交至野生型靶基因组区、含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的同源定向修复引入的HDR突变的靶基因组区，和含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的NHEJ修复引入的NHEJ突变的靶基因组区；v)可检测标记的寡核苷酸HDR探针，其中HDR探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交；和vi)可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落探针，其中所述NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区杂交，并且其中所述NHEJ脱落探针不与含有NHEJ突变的靶基因组区杂交；b)扩增多个混合物划分产物中的靶基因组区；并且c)通过检测多个混合物划分产物中标记的探针与靶基因组区的杂交来确定野生型靶基因组区的量、含有HDR突变的靶基因组区的量，和含有NHEJ突变的靶基因组区的量。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.09 US 62/101,828;2015.08.05 US 62/201,4461.一种对细胞样品中同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物同时定量的方法，其中所述细胞样品包含已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触的细胞，所述方法包括：a)形成多个具有平均体积的混合物划分产物，其中混合物划分产物包含：i)靶基因组区；ii)DNA-依赖性DNA聚合酶；iii)正向和反相寡核苷酸扩增引物，其中所述正向和反应引物与靶基因组区的相反链杂交并侧接靶基因组区，并且其中引物设置成在聚合酶存在下扩增靶基因组区；iv)可检测标记的寡核苷酸参考探针，其中参考探针杂交至野生型靶基因组区、含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的同源定向修复引入的HDR突变的靶基因组区，和含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的NHEJ修复引入的NHEJ突变的靶基因组区；v)可检测标记的寡核苷酸HDR探针，其中HDR探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交；和vi)可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落探针，其中所述NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区杂交，并且其中所述NHEJ脱落探针不与含有NHEJ突变的靶基因组区杂交；b)扩增多个混合物划分产物中的靶基因组区；并且c)通过检测多个混合物划分产物中标记的探针与靶基因组区的杂交来确定野生型靶基因组区的量、含有HDR突变的靶基因组区的量，和含有NHEJ突变的靶基因组区的量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述参考和HDR探针包含相同的可检测标记物。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HDR探针不与野生型靶基因组区杂交。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NHEJ脱落探针不与含有HDR突变的靶基因组区杂交。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NHEJ脱落探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA依赖性DNA聚合酶包含5’至3’外切核酸酶活性，和c)包括检测多个混合物划分产物中由对杂交的标记的探针的5’至3’外切核酸酶消化导致的荧光增加。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个混合物划分产物还包含HDR暗寡核苷酸探针，其中该HDR暗探针包含不可由DNA聚合酶延伸的3’末端，并且其中所述HDR暗探针与所述HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NHEJ脱落探针与所述HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述位点特异性基因组编辑试剂是CRISPR-Cas9试剂、TALEN、或锌指核酸酶。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述位点特异性基因组编辑试剂包括2种位点特异性基因组缺刻酶，其中各缺刻酶设置成在其他缺刻酶的不到约1kb以内切开细胞基因组中的靶DNA。11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括，在形成多个混合物划分产物之前，提供细胞样品并提取靶基因组区。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述提供包括使多个细胞与位点特异性基因组编辑试剂接触。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，向患者给予与位点特异性基因组编辑试剂接触的多个细胞，并且所述提供包括提供来自已经向其给予细胞的患者的细胞样品。14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述提供还包括使所述多个细胞与HDR模板核酸接触，其中所述HDR模板核酸包含靶基因组区的部分的突变并且设置成在对靶基因组区的同源定向修复期间发挥模板作用，从而将HDR突变引入靶基因组区。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述HDR模板核酸包括DNA。16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述HDR模板核酸是单链DNA寡核苷酸。17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个混合物划分产物包含多个结构上不同的可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落探针，其中所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区的不同亚区杂交。18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交。19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且不与HDR突变的亚区杂交。20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且与含有HDR突变的靶基因组区杂交。21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，c)包括通过对以下进行检测并计数来确定样品中具有NHEJ突变的靶基因组区的浓度：i)不含靶基因组区的混合物划分产物的总数；和ii)以下部分的总数：-其中仅检测到含NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；和-不含靶基因组区的混合物划分产物，其中浓度计算为多个混合物划分部分的平均体积的倒数乘以i)除以ii)的比率的负自然对数。22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，c)包括通过对以下进行检测和计数来确定样品中具有HDR突变的靶基因组区的浓度：i)以下的总数：-不含靶基因组区的混合物划分产物；-其中仅检测到含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；-其中仅检测到野生型靶基因组区的混合物划分产物；和-其中仅检测到野生型靶基因组区和含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；和ii)以下的总数：-i)；和-其中检测到HDR突变的混合物划分产物，其中浓度计算为多个混合物划分产物的平均体积的倒数乘以i)除以ii)的比率的负自然对数。23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，c)包括通过对以下进行检测和计数来确定样品中野生型靶基因组区的浓度：i)以下的总数：-不含靶基因组区的混合物划分产物；和-其中仅检测到含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；和ii)以下的总数：-i)；-其中仅检测到野生型靶基因组区的混合物划分产物；和-其中仅检测到野生型靶基因组区和含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；并且其中浓度计算为多个混合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·伯曼，S·库珀，G·卡琳纽曼，宫冈佑一郎，B·康克林，J·施诺夫，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，J·大卫格莱斯顿学会，
类型：发明
国别省市：美国,US