改进植物中的蛋白产生制造技术

提供了在植物或植物部分内合成目的蛋白的方法。所述方法包括处理植物以增加次生叶生物质产生，随后将编码目的蛋白的与在植物中有活性的调控区可操作地连接的一种或一种以上核酸序列引入植物中。然后将植物维持在允许编码目的蛋白的核酸序列在植物或植物部分中表达的条件下。任选地，可以收获植物或植物部分并提取目的蛋白。

Improving protein production in plants

Methods for synthesizing target proteins in plants or plant parts are provided. The method includes processing plants to increase secondary leaf biomass production, then encoding protein and activity in plants in the control region is operably connected to one or more nucleic acid sequences introduced in plants. The plant is then maintained under the condition that nucleic acid sequences that permit the encoding of the target proteins are expressed in plants or parts of the plant. Optionally, a plant or plant part can be harvested and the target protein is extracted.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进植物中的蛋白产生专利
本专利技术涉及在植物中产生蛋白的方法。本专利技术还提供了增加植物中一种或多种蛋白产生的方法。专利技术背景基于植物的蛋白表达平台是应对全世界生物治疗学和诊断学增长需求的有用解决方案。与细菌或酵母不同，植物细胞能够正确折叠、组装并修饰哺乳动物来源的复杂蛋白，如治疗或诊断用抗体。与基于哺乳动物细胞的产生系统相比，植物还在安全性、资本投资和容易放大方面呈现优势。因此，植物是用于产生当前应用于生命科学中的蛋白(诸如，例如mAbs或病毒抗原，如来自流感的HA)的合适宿主。WO07016276公开了稳定转化植物的方法，其通过在两片子叶接触的点切开幼苗以去除两片子叶和最初的真叶，并且允许从切割面长出新枝。该方法包括使植物受伤，以利于在受伤部位引入农杆菌并提高转化效率。将切除的幼苗在细菌悬液中涡旋，所述悬液中包含携带期望的转移DNA的转化质粒。受伤的步骤是转化步骤之前所必须的。精确的切割介导的转化能够导致稳定转化从幼苗的切割面出现的新枝。这些枝能够发育成植物的地上部分，并由此产生转化的子代。Spokevicus等(FunctionalPlantBiology2006)公开了杨属树木中休眠侧芽(DLB)的体内转化。通过中央垂直切割使DLB受伤，或者去除植物的顶部，并将剩下的DLB通过垂直切割、添加保护层或添加根瘤农杆菌(A.tumefaciens)相结合来处理。利用这种方法，受伤的步骤是转化步骤之前所必须的。WO2008/151444公开了利用瞬时表达系统在植物内合成目的蛋白的方法。在期望的核酸构建体浸润之前，植物被修剪。在用转化有合适的质粒的农杆菌菌株真空浸润叶之前，通过挤压机械从植物去除或化学修剪本氏烟(N.benthamiana)植株的顶芽和腋芽。Wydro等(ActaBiochimicaPolonica，Vol53No.2/2006289-298)公开了在用根瘤农杆菌浸润的本氏烟的最新的叶(位于植株的顶部)中检测到了最高水平的瞬时绿色荧光蛋白(GFP)基因表达，而在位于中间和底部位置处的较老的叶中的表达则较低。Halfhill等(PlantCellRep22:338-343，2003)提出，GFP荧光的变化与叶老化过程中可溶性蛋白浓度的改变相关。在不同位置处的单片叶中，gfp基因表达的水平和可溶性蛋白的浓度在相似的时间并以相似的程度下降。Wydro等提出这两个因素之间的密切关联暗示GFP表达的下降是叶生理机能综合变化的结果。通过开发利用农杆菌浸润瞬时蛋白表达的高产系统已增强了在植物中表达临床上有用的蛋白。存在在植物中优化表达并增加重组蛋白的数量和质量的需求。专利技术概述本专利技术涉及在植物中产生蛋白的方法。本专利技术还提供了增加植物中一种或多种蛋白产生的方法。本专利技术的目的是提供在植物中产生蛋白的改进方法。本专利技术提供了在植物或植物部分内产生目的蛋白的方法，其包括：a)处理所述植物或植物部分以增加所述植物或植物部分中的次生叶生物质产生；b)将一种或一种以上核酸引入所述植物或植物部分，所述核酸包含编码所述目的蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列与在植物中有活性的调控区可操作地连接；c)在允许编码所述目的蛋白的核苷酸序列表达的条件下培育所述植物或植物部分，由此产生所述目的蛋白，其中与在相同条件下生长但未经处理以增加次生叶生物质的相似植物的相同植物组织获得的目的蛋白的产量相比，所述目的蛋白的产量增加。可用于上述方法中的目的蛋白可以为抗体、抗原、疫苗或酶。目的蛋白可以为流感HA蛋白，并且在植物或植物部分中表达时，HA可以形成流感病毒样颗粒(VLP)。一种或一种以上核酸可以被引入植物或植物部分中，所述植物或植物部分的次生叶生物质与初生叶生物质之比为0.2:1至3:1。本专利技术还提供了如上所述的方法，其中从引入一种或一种以上核酸的步骤之前约40天直到引入一种或一种以上核酸的当天，或者从引入一种或一种以上核酸的步骤之前约40天直到收获植物或植物部分的当天实施步骤a)的处理步骤。本专利技术包括如上所述的方法，其中步骤a)的处理植物的步骤，包括：增加植物生长过程中的光持续时间，增加植物生长过程中的光强度，选择生长过程中植物所暴露的波长，修剪植物初生茎的顶芽，在存在增加次生枝发育的试剂、激素或其组合的情况下培育植物，施加减弱顶端优势的化合物，机械修剪，化学修剪，基因修饰敲入、敲除，以及促进次生生长的植物育种，或以上的组合。在如上所述的方法中，可以在存在植物激素的情况下培育植物。例如，可以在存在约50ppm至900ppm植物激素的情况下培育植物。植物激素可以是合成的细胞分裂素，例如6-苄氨基嘌呤(BAP)。本专利技术还包括如上所述的方法，其中所述方法还包括收获植物以及任选地纯化目的蛋白的步骤。在收获步骤中，可以收获次生叶，或者初生叶和次生叶。此外，可以收获次生叶、来自初生茎的中间叶(P2)和来自初生茎的新叶(P1)，或者可以收获来自初生茎的中间叶(P2)、来自初生茎的新叶(P1)、来自次生茎的老叶(S3)、来自次生茎的中间叶(S2)和来自次生茎的新叶(S1)。此外，可以不收获来自植物初生茎的老叶(P3)。本专利技术提供了如上所述的方法，其中在步骤b)的引入步骤中，核酸在植物中瞬时表达或者核酸在植物中稳定表达。通过增加次生叶生物质，与未经处理以增加次生生物质并在相同条件下生长的植物的相同植物组织获得的目的蛋白的产量相比，可以获得来自初生生物质和次生生物质的蛋白产量的增加。本专利技术的概述未必描述了本专利技术的所有特征。附图说明从以下参照附图的描述中，本专利技术的这些和其它特征将变得更加显而易见，其中：图1显示了在温室中不同的光周期(16h和24h)和光强度处理(80和160μmol/m2.s)下，浸润之前在生长的植物的生物质产生。收获主茎的新叶(P1)、成熟叶(P2)和老叶(P3)以及次生茎的新叶(S1)、成熟叶(S2)和老叶(S3)，并测定生物质。图2显示了在不同的光周期(16h和24h)和光强度处理(80和160μmol/m2.s)下，主茎的新叶(P1)、成熟叶(P2)和老叶(P3)以及次生茎的新叶(S1)、成熟叶(S2)和老叶(S3)中的HA产生。图3显示了在不同的光周期(16h和24h)和光强度处理(80和160μmol/m2.s)下，主茎的新叶(P1)、成熟叶(P2)和老叶(P3)以及次生茎的新叶(S1)、成熟叶(S2)和老叶(S3)中的HA总产量(HA/植株)。图4显示了在不同的光周期(16h和24h)和光强度处理(80和160μmol/m2.s)下，主茎的叶(底部(P))和次生茎的叶(顶部(S))中的HA总产量。图5显示了在生长室中低光强度或高光强度下生长的植物的生物质产生。收获主茎的新叶(P1)、成熟叶(P2)和老叶(P3)以及次生茎的新叶(S1)、成熟叶(S2)和老叶(S3)，并测定生物质。图6显示了在生长室中低光强度或高光强度下生长的每株植物的HA总产量。收获主茎的新叶(P1)、成熟叶(P2)和老叶(P3)以及次生茎的新叶(S1)、成熟叶(S2)和老叶(S3)，并测定每株植物的HA总产量。图7显示了具有初生叶(P1、P2、P3)和次生叶(SI1、S2、S3)的植物的示意图。图8显示了修剪(在这种情况下，在幼苗移植后5、7或12天从本文档来自技高网...

【技术保护点】
在植物或植物部分内产生目的蛋白的方法，其包括：a)处理所述植物或植物部分以增加所述植物或植物部分中的次生叶生物质产生；b)将一种或一种以上核酸引入所述植物或植物部分，所述核酸包含编码所述目的蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列与在植物中有活性的调控区可操作地连接；c)在允许编码所述目的蛋白的核苷酸序列表达的条件下，培育所述植物或植物部分，由此产生所述目的蛋白，其中与在相同条件下生长但未经处理以增加次生生物质的相似植物的相同植物组织获得的目的蛋白的产量相比，所述目的蛋白的产量增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.11 US 62/023,7181.在植物或植物部分内产生目的蛋白的方法，其包括：a)处理所述植物或植物部分以增加所述植物或植物部分中的次生叶生物质产生；b)将一种或一种以上核酸引入所述植物或植物部分，所述核酸包含编码所述目的蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列与在植物中有活性的调控区可操作地连接；c)在允许编码所述目的蛋白的核苷酸序列表达的条件下，培育所述植物或植物部分，由此产生所述目的蛋白，其中与在相同条件下生长但未经处理以增加次生生物质的相似植物的相同植物组织获得的目的蛋白的产量相比，所述目的蛋白的产量增加。2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a)的处理步骤中，所述植物或植物部分的次生叶生物质与初生叶生物质之比为0.2:1至3:1。3.如权利要求1所述的方法，其中从引入一种或一种以上核酸的步骤之前约40天直到且包括引入所述一种或一种以上核酸的当天，或者从引入一种或一种以上核酸的步骤之前约40天直到且包括收获所述植物或植物部分的当天，实施步骤a)的处理植物的步骤。4.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤a)的处理植物的步骤，包括增加植物生长过程中的光持续时间，增加植物生长过程中的光强度，修剪植物的顶芽，在存在增加次生茎形成的试剂、激素或其组合的情况下培育植物，施加减弱顶端优势的化合物，或者以上的组合。5.如权利要求4所述的方法，其中所述修剪包括机械修剪或化学修剪。6.如权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：多米尼克·米考德，斯蒂夫·珀皮恩，吉尔伯特·艾西尔，玛丽克莱尔·古利特，琳达·高德瑞奥，玛耶勒·加涅，米歇尔·马特尔，尼克尔·贝克托尔德，马克安德烈·道斯特，安德烈·戈瑟兰，
申请(专利权)人：莫迪卡戈公司，拉瓦勒大学，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA