提供了在植物中产生包含修饰的血凝素的病毒样颗粒(VLP)的方法。所述方法包括将包含调控区的核酸引入所述植物或所述植物的部分，所述调控区在植物中有活性并且与编码修饰的流感血凝素(HA)蛋白质的核苷酸序列可操作地连接，所述修饰的HA蛋白包含修饰的蛋白水解环。在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或所述植物的部分后，从而产生所述VLP。所述修饰的蛋白水解环可包含呈现出减少或废除的蛋白酶切割的一个或多个蛋白酶切割位点。编码所述HA的所述核苷酸序列可选自：B HA、C、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。也描述了通过所述方法产生的病毒样颗粒(VLP)，以及表达所述VLP的植物。所述病毒样颗粒(VLP)可包含植物‑特异性N‑聚糖，或修饰的N‑聚糖。
【技术实现步骤摘要】
植物中流感样病毒颗粒的产生专利
本专利技术涉及在植物中产生病毒样颗粒。专利技术背景流感是由正粘液病毒科的RNA病毒引起的。存在三种类型的这些病毒，并且它们引起三种不同类型的流感：A型、B型和C型。流感病毒的A型病毒感染哺乳动物(人、猪、雪豹、马)和禽类。该病毒类型对人类来说非常重要，因为这是引起全世界流行病的病毒类型。B型流感病毒(也被简称为流感B)仅感染人类。其偶尔引起流感的局部爆发。C型流感病毒同样仅感染人类。当它们未成熟时它们感染大多数人并且极少引起严重的疾病。接种疫苗通过诱导对象在感染之前建立防御，提供免受由类似病原体引起的疾病的保护。按照惯例，通过使用减毒活形式或完全灭活形式的感染性病原体作为免疫原实现接种疫苗。为了避免使用完整病毒(如杀死的或减毒的病毒)作为疫苗的危险，重组的病毒蛋白，例如亚基，已被用作疫苗。肽和亚基疫苗均为有许多潜在限制的对象。由于不正确的折叠或弱的抗原递呈，亚基疫苗可能呈现弱的免疫原性。主要的问题是难以确保被改造的蛋白的构象模仿抗原在其自然环境中的构象。合适的佐剂以及在肽的情况下的载体蛋白必须被用来促进免疫应答。此外这些疫苗主要引起体液应答，并且因此可能未能激发有效的免疫力。亚基疫苗通常对疾病是无效的，可证明完整的灭活病毒能提供保护。病毒样颗粒(VLP)为用于免疫原性组合物中的包含物的潜在候选物。VLP极其类似于成熟病毒粒子，但是它们不含有病毒基因组材料。因此，VLP本质上是非复制性的，这使得它们用于作为疫苗施用是安全的。此外，可改造VLP以在VLP的表面上表达病毒糖蛋白，其为它们最天然的生理性结构。而且，因为VLP类似于完整的病毒粒子并且为多价的微粒结构，所以VLP在诱导针对糖蛋白的中和抗体中，比可溶性包膜蛋白抗原更有效。VLP已在植物(WO2009/009876；WO2009/076778；WO2010/003225；WO2010/003235；WO2011/03522；WO2010/148511；其通过引用并入本文)，以及昆虫和哺乳动物系统中(Noad,R.andRoy,P.，2003，TrendsMicrobiol11：438-44；Neumann等，2000，J.Virol.，74，547-551)产生。Latham和Galarza(2001，J.Virol.，75，6154-6165)报道了，在感染有共表达血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、M1和M2基因的重组杆状病毒的昆虫细胞中，流感VLP的形成。该研究证明，在真核细胞中经共表达的流感病毒粒子蛋白的自我组装，并且M1基质蛋白是用于VLP的产生所必需的。Gomez-Puertas等(1999，J.Gen.Virol，80，1635-1645)显示M2的共表达完全地阻碍了CATRNA传送至MDCK培养基中。流感病毒的刺突糖蛋白血凝素(HA)对病毒颗粒被宿主细胞摄取非常重要。它负责病毒颗粒附着于包括唾液酸的细胞受体上，并且它涉及通过病毒包膜与细胞膜融合的病毒侵入。融合活性以及从而病毒的感染性，取决于将HA前体分子HA0切割为二硫键连接的多肽链HA1和HA2。切割随后pH-依赖的构象变化导致调节膜融合的跨膜多肽HA2在氨基端处的高度保守疏水肽的暴露和再定位。HA被合成为前体蛋白HA0，其经过蛋白水解作用加工为通过二硫键连在一起的两个亚基(HA1和HA2)。两种结构特征被认为是涉及HA的可切割性：在有限的可切割性的HA中，接头通常由单个精氨酸组成，然而较宽范围的不同细胞种类中可切割的HA在具有主要酶识别基序Arg-X-Lys/Arg-Arg(其中X为非碱性氨基酸)的该位置上具有一系列的多个碱性残基插入。具有多个碱性切割位点的HA在其到达细胞膜上的出芽位点前在细胞外转运途径中被切割，相反，具有单碱性接头的HA在细胞外间隙或如针对WSN毒株所示在病毒进入阶段，在病毒颗粒上被激活。HA切割的第二个决定因素似乎为，存在于切割位点附近并且干扰蛋白酶易接近性的碳水化合物侧链。该碳水化合物的损失导致提高HA的可切割性和病毒的致病性。由于分泌可细胞外切割HA0前体的蛋白酶的细胞范围有限，哺乳类和非致病性禽流感病毒株引起解剖学上的局部感染(ChenJ等.1998，Cell.Vol95：409-417)。负责在流感感染的人类中切割HA0的蛋白酶，由呼吸道的细胞或由共感染的细菌或支原体分泌，或者它们可在对感染的炎症应答中产生。主要的蛋白酶候选物为类胰蛋白酶克拉拉(Clara)，其由支气管上皮的克拉拉细胞产生，并且具有有限的组织分布(上呼吸道)。蛋白酶对H1、H2、H3和H6的切割位点处发现的单碱性序列Q/E-X-R具有特异性。来自H9和B毒株的HA显示稍有不同的单碱性切割位点，分别为SSR和KER序列。针对引起水禽中所见的肠道和呼吸道感染的大多数流感病毒，还未鉴定出蛋白酶。大多数细胞系不支持多轮复制，除非加入外源蛋白酶(通常为胰蛋白酶)。在高致病禽流感毒株中，然而，HA0被更普遍的细胞内蛋白酶家族切割，其导致全身的流感感染。致病性中的这种差异与HA0切割位点处的结构差异相关。致病毒株在单碱性位点内或邻近单碱性位点处具有多碱性氨基酸的插入。在该情况下的切割发生于细胞内，并且所涉及的蛋白酶被鉴定为弗林蛋白酶(Furin)和其他类谷草杆菌蛋白酶，其发现于高尔基体中并涉及激素和生长因子前体的翻译后加工。弗林蛋白酶的识别序列R-X-R/K-R为H5H7的HA0切割位点处常见的插入氨基酸。酶的广泛组织分布性以及细胞内切割的效能，有助于由这些病毒引起的广泛传播的和毒力的全身性感染。HA切割位点是用于病毒减毒的靶标，因为通过宿主蛋白酶将HA0前体激活切割为HA1和HA2片段，是所有流感A和B病毒株的复制循环中的步骤。只有被切割的HA能在受体介导的胞吞作用后的核内体酸性环境中经历构象变化，以暴露用于介导核内膜和病毒粒子膜之间融合的HA2片段的疏水N末端。HorimotoT等(2006，Vaccine，Vol24：3669-3676)描述了H5中H5(RERRRKKR↓G)的多碱性切割位点的废除。所选择的突变体被应用于鼠中免疫原性的研究，其包括具有前面4个带电氨基酸(RERR)的缺失并且使多碱性切割位点失活的修饰(用TETR代替RKKR)的突变体。切割位点的废除不影响突变体H5的免疫原性特性。也已报道，废除多碱性位点(GERRRKKR↓G被RETR代替)以产生突变体NIBSC05/240NIBSC流感参考病毒NIBG-23。Hoffman等(2002，2002，Vaccine，Vol20：3165-3170)用H6的单碱性位点代替H5HA的多碱性切割位点，以便促进在卵中的表达。缺失前面4个残基，并且通过IETR代替多碱性位点的后面四个氨基酸(用IETR↓G代替RERRRKKR↓G)。该突变体H5表现出高的表达水平、潜在的蛋白水解作用，以及在宿主细胞中病毒复制和产生所需的低pH下的构象变化，免疫原性数据未被报道。这些研究表明，可利用切割位点的修饰来减少病毒颗粒的毒力(在真实病毒被复制的情况下)，其允许病毒在不杀死寄生卵的情况下复制。如果没本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.修饰的流感血凝素(HA)，其完全缺失了位于HA1亚基和HA2亚基之间的蛋白水解环，其中：/n所述修饰的流感HA是与SEQ ID NO：98的氨基酸25-576、SEQ ID NO：100的氨基酸25-576、SEQ ID NO：168的氨基酸25-577、SEQ ID NO：194的氨基酸25-576或SEQ ID NO：199的氨基酸25-576具有至少90％的序列同一性的流感B型HA，/n所述修饰的流感HA是与SEQ ID NO：143的氨基酸25-559或SEQ ID NO：147的氨基酸25-559具有至少90％的序列同一性的流感A型H3亚型HA，或/n所述修饰的流感HA是与SEQ ID NO：154的氨基酸25-549具有至少90％的序列同一性的流感A型H7亚型HA。/n
【技术特征摘要】
20130328 US 61/806,227;20140110 US 61/925,852;20141.修饰的流感血凝素(HA)，其完全缺失了位于HA1亚基和HA2亚基之间的蛋白水解环，其中：
所述修饰的流感HA是与SEQIDNO：98的氨基酸25-576、SEQIDNO：100的氨基酸25-576、SEQIDNO：168的氨基酸25-577、SEQIDNO：194的氨基酸25-576或SEQIDNO：199的氨基酸25-576具有至少90％的序列同一性的流感B型HA，
所述修饰的流感HA是与SEQIDNO：143的氨基酸25-559或SEQIDNO：147的氨基酸25-559具有至少90％的序列同一性的流感A型H3亚型HA，或
所述修饰的流感HA是与SEQIDNO：154的氨基酸25-549具有至少90％的序列同一性的流感A型H7亚型HA。
2.如权利要求1所述的修饰的流感HA，其中所述修饰的HA包含天然的HA信号肽或非天然的HA信号肽。
【专利技术属性】
技术研发人员：曼侬·库特里，马克安德烈·蒂奥斯特，路易斯菲利普·维泽纳，
申请(专利权)人：莫迪卡戈公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA
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