提供了表达增强子，其依次包含CPMV 5’UTR核苷酸序列和填充片段，所述CPMV 5’UTR核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1‑160或者包含与SEQ ID NO:1具有约80％至100％的序列相似性的核苷酸序列；所述填充片段包含编码不完全的M蛋白的核苷酸序列以及在植物中有活性的一种或多种kozak序列。还描述了包含所述表达增强子的植物和植物物质，以及使用所述表达增强子的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及目的蛋白在植物中的表达。本专利技术还提供用于在植物中产生目的蛋白的方法和组合物。专利技术背景植物作为重组蛋白的产生系统具有巨大的潜力。在植物中产生外源蛋白的一种方法是产生稳定的转基因植物系。然而，该方法耗时且劳动密集。转基因植物的替代方案是使用基于植物病毒的表达载体。基于植物病毒的载体允许在植物中快速、高水平、瞬时表达蛋白。在植物中实现外源蛋白的高水平瞬时表达的一种方法涉及使用基于RNA植物病毒的载体，包括豇豆花叶病毒组，如豇豆花叶病毒(Cowpeamosaicvirus)(CPMV；参见，例如WO2007/135480；WO2009/087391；US2010/0287670,SainsburyF.等，2008,PlantPhysiology；148:121-1218；SainsburyF.等，2008,PlantBiotechnologyJournal；6:82-92；SainsburyF.等，2009,PlantBiotechnologyJournal；7:682-693；SainsburyF.等，2009,MethodsinMolecularBiology,RecombinantProteinsFromPlants,vol.483:25-39)。豇豆花叶病毒组是具有二重基因组的RNA病毒。豇豆花叶病毒组RNA基因组的片段被称为RNA-1和RNA-2。RNA-1编码VPg、复制酶和蛋白酶蛋白。复制酶是病毒所需的，用于病毒基因组的复制。豇豆花叶病毒组豇豆花叶病毒(CPMV)的RNA-2产生105kDa或95kDa的多肽，其被加工为4个功能肽。CPMVRNA-2的5’区包含位于115位、161位、512位和524位的起始密码子(AUG)。位于161位和512位的起始密码子处于同一三联体阅读框内。在位于161位起始密码子处的起始导致105K多蛋白的合成，而在位于512位起始密码子处的起始指导95K多蛋白的合成。在CPMV的512位起始密码子处的翻译起始比在161位处的起始更高效，导致产生比105K多蛋白更多的95K多蛋白。位于115位的起始密码子对于病毒复制不是必要的(Wellink等，1993Biochimie.75(8):741-7)。RNA-2通过RNA-1编码的复制酶的高效复制需要维持CPMVRNA-2中161位和512位的起始位点之间的框架(Holness等，1989；Virology172,311-320；vanBokhoven等，1993,Virology195,377-386；Rohll等，1993Virology193,672-679；Wellink等，1993,Biochimie.75(8):741-7)。该需求影响可被插入复制形式的CPMVRNA-2表达载体中512位处起始密码子上游的序列的长度。此外，多接头的使用应当谨慎，因为它们可使开放阅读框(ORF)在这些起始位点之间移动。CPMV被用作发展适于在植物中产生异源多肽的载体系统的基础(Liu等，2005Vaccine23,1788-1792；Sainsbury等，2007VirusExpressionVectors(Hefferon,K.ed),pp.339-555)。这些系统基于RNA-2的修饰，但是不同之处在于使用全长形式还是或者缺失形式。通过与RNA-1共接种(co-inoculation)实现修饰的RNA-2的复制。外源蛋白与RNA-2来源的多蛋白的C端融合。N端多肽的释放由来自口蹄疫病毒的2A催化肽序列的作用介导(Gopinath等，2000,Virology267:159-173)。得到的RNA-2分子既能在植物内传播，又能在植物间传播。该策略已被用于在豇豆植物中表达多种重组蛋白，如乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和小免疫蛋白(SIP)(Mechtcheriakova等，J.Virol.Methods131,10-15；2006；Monger等，2006,植物Biotechnol.J.4,623-631；Alamillo等，2006,Biotechnol.J.1,1103-1111)。尽管成功，但是全长病毒载体的使用限制了插入序列的大小，并且在植物之间的移动引发了关于病毒的生物防护的担忧。为了解决生物防护和插入大小的问题，Canizares等人(2006PlantBiotechnol,J4:183-193)用目的序列替代了RNA-2的大部分编码区，以产生无能形式的CPMVRNA-2(deIRNA-2)。将待表达的序列与RNA-2位于512位的AUG融合，紧接3'非翻译区(UTR)的上游，以产生模拟RNA-2的分子。在RNA-1和沉默抑制基因的存在下，当被引入植物时，此类构建体能够复制，并指导高水平的异源蛋白的合成(Sainsbury等，2008PlantBiotechnolJ6:82-92)。CPMVRNA-2载体中位于161位的起始密码子的突变(U162C；HT)增加了由位于512位的起始密码子之后插入的序列所编码的蛋白的表达水平。这允许高水平的外源蛋白的产生，而无需病毒复制，并将其称为CPMV-HT系统(WO2009/087391；Sainsbury和Lomonossoff,2008,PlantPhysiol.148,1212-1218)。在pEAQ表达质粒(Sainsbury等，2009,PlantBiotechnologyJournal,7,pp682-693；US2010/0287670)中，待表达的序列位于5’UTR和3’UTR之间。pEAQ系列中的5’UTR携带U162C(HT)突变。专利技术概述本专利技术涉及目的蛋白在植物中的表达。本专利技术还提供用于在植物中产生目的蛋白的方法和组合物。如本文所述，提供表达增强子，其依次包含CPMV5’UTR核苷酸序列和填充序列，所述CPMV5’UTR核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1-160或者包含与SEQIDNO:1具有约80％至100％序列相似性的核苷酸序列，所述填充片段包含编码不完全M蛋白的核苷酸序列、在植物中有活性的一种或多种kozak序列，或者这两种均包含。填充片段可以包含10至约500个核苷酸的长度，或者其间的任意长度。填充片段的不完全的M蛋白可以包含约10至约351个核苷酸的长度，或者其间的任意长度。填充片段还可以包含多克隆位点。多克隆位点包含约0至约100个核苷酸的长度，或者其间的任意长度。还提供如上文所述的表达增强子，其中kozak序列选自如SEQIDNO：5-17中所示的序列。还提供包含含有调控区的核酸序列的植物表达系统，所述核酸序列与表达增强子可操作地连接，所述表达增强子依次包含CPMV5’UTR核苷酸序列和填充片段，所述CPMV5’UTR核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1-160或者包含与SEQIDNO:1具有约80％至100％的序列相似性的核苷酸序列，所述填充片段包含编码不完全的M蛋白的核苷酸序列和一种或多种kozak序列，表达增强子与目的核苷酸序列可操作地连接。植物表达系统还可以包含豇豆花叶病毒组3’UTR。植物表达系统还可以包含编码沉默抑制因子的第二核酸序列，例如HcPro或p19。如上文所限定的本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达增强子，其依次包含CPMV 5’UTR核苷酸序列和填充片段，所述CPMV 5’UTR核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1‑160或者包含与SEQ ID NO:1具有约80％至100％的序列相似性的核苷酸序列，所述填充片段包含编码不完全的M蛋白的核苷酸序列以及在植物中有活性的一种或多种kozak序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.28 CA PCT/CA2014/050326;2014.03.27 US 61/91.表达增强子，其依次包含CPMV5’UTR核苷酸序列和填充片段，所述CPMV5’UTR核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1-160或者包含与SEQIDNO:1具有约80％至100％的序列相似性的核苷酸序列，所述填充片段包含编码不完全的M蛋白的核苷酸序列以及在植物中有活性的一种或多种kozak序列。2.如权利要求1所述的表达增强子，其中所述填充片段包含50至约500个核苷酸的长度或者其间的任意长度。3.如权利要求2所述的表达增强子，其中所述填充片段还包含多克隆位点。4.如权利要求1所述的表达增强子，其中所述kozak序列选自如SEQIDNO：5-17中所示的序列。5.如权利要求1所述的表达增强子，其中所述编码不完全的M蛋白的核苷酸序列包含约50至约351个核苷酸的长度，或者其间的任意长度。6.如权利要求5所述的表达增强子，其中所述编码不完全的M蛋白的核苷酸序列为349或351个核苷酸的长度。7.如权利要求1所述的表达增强子，其选自SEQIDNO：1、3、4或56。8.植物表达系统，其包含含有调控区的核酸序列，所述调控区与权利要求1所述的表达增强子以及目的核苷酸序列可操作地连接。9.如权利要求8所述的植物表达系统，其还包含豇豆花叶病毒组3’UTR。10.如权利要求9所述的植物表达系统，其还包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码沉默抑制子。11.如权利要求10所述的植物表达系统，其中所述沉默抑制子选自HcPro和p19。12.如权利要求8所述的植物表达系统，其中所述调控区选自：质体蓝素启动子、CaMV35S启动子、2xCaMV35S启动子、CAS启动子、RbcS启动子、Ubi启动子或者肌动蛋白启动子。13.如权利要求8所述的植物表达系统，...
【专利技术属性】
技术研发人员：马克安德烈·蒂奥斯特，皮埃尔奥利维耶·拉瓦伊，
申请(专利权)人：莫迪卡戈公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA
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