罗非鱼湖病毒S8基因编码的重组蛋白、由其制备的抗体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种罗非鱼湖病毒S8基因编码的重组蛋白及其应用。所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码该蛋白的核酸碱基序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术获得的重组蛋白具有较好的免疫原性，能诱导免疫动物产生较高效价的特异性抗体，且该特异性抗体具有较强的病毒中和活性，能中和病毒使其使其感染性，且以抗该重组蛋白抗体可以作为罗非鱼湖病毒病的一种治疗性药物。因此，本发明专利技术的罗非鱼湖病毒S8基因及其编码蛋白，对开发罗非鱼湖病毒病新型疫苗、免疫学检测试剂盒及治疗产品具有重要的意义，为罗非鱼湖病毒病提供有效的解决途径。

【技术实现步骤摘要】
罗非鱼湖病毒S8基因编码的重组蛋白、由其制备的抗体及应用
本专利技术属于生物基因工程领域，具体涉及由罗非鱼湖病毒S8基因编码的重组VP20抗原蛋白及其应用。
技术介绍
罗非鱼为大多数发展中国家提供了一种廉价的蛋白质来源，罗非鱼养殖对全球粮食安全作出了重大贡献。据估计，2015年全球罗非鱼产量为640万吨，其产量仅次于鲤科鱼类稳居水产品第二。然而，自2009年以来暴发了一种新型RNA病毒-罗非鱼湖病毒，简称罗湖病毒(TilapiaLakeVirus，TiLV)，给全世界的罗非鱼养殖带来巨大威胁和严峻挑战。罗非鱼湖病毒初步确定为类正粘病毒(resemblingOrthomyxovirus)，一种高度传染性的烈性病毒，感染罗非鱼湖病毒可导致罗非鱼死亡率高达70～90％，由于TiLV具有高传染性和高死亡率等特点，引起了全球罗非鱼养殖产业的高度恐慌和重视，该疫病一旦全面爆发和流行，必将给罗非鱼养殖业造成毁灭性打击。这一由罗非鱼湖病毒导致的水生动物新发疫病引起了全球罗非鱼养殖业及相关产业的高度重视。虽然在水产养殖中没有治愈任何病毒性疾病的方法，但疫苗免疫和选择性育种可以降低某些病毒性疾病危害。由于TiLV为新发疫病，基础研究较为薄弱，目前还没有有效的疫苗，开发一种安全、高效且廉价的疫苗是今后控制该疫病的重点发展方向。目前，最为迫切且可实现的是需要一种早期、快速的预警诊断方法，对罗非鱼养殖场进行病原筛查，有必要对受感染的农场进行隔离，并采取及时的控制措施。目前，如逆转录PCR(RT-PCR)(Eyngoretal.2014)，巢式PCR检测(KembouTsofacketal.2017；Dongetal.2017)，逆转录定量实时PCR(RT-qPCR)(KembouTsofacketal.2017；Tattiyapongetal.2017)已被开发用于检测TiLV。然而，上述方法均未在实际生产中获得应用，且都是基于对病毒核酸的检测方法。由于罗非鱼经常由低收入农民养殖，因此需要低成本、快速和准确的诊断方法，不需要特殊的实验条件和昂贵仪器设备。目前尚无有效可靠的检测TiLV免疫学检测方法。因此，针对罗非鱼湖病毒病的防控，学者们提出今后重点研究方向是：(1)开发出更为精准、便捷及廉价的现场快速诊断技术及产品；(2)高效疫苗的开发及应用；(3)治疗性药物的开发及应用；(4)传播途径的研究及切断。TiLV是一种具有10个基因组节段(Segment1～10，S1～S10)的负链RNA病毒。Til-4-2011是第一个完成全基因组测定的罗湖病毒分离株，被认为是一个标准毒株。该分离株的基因组总大小为10323bp，S1到S10(GenBank登记号为KU751814～KU751823)大小依次降低，其中S1最大，为1641bp，S10最小，为465bp。所有节段的5′和3′末端均存在“5′-GUAAUU…UUCAUC-3′”的保守序列。各基因节段及其编码的蛋白功能均未知。其中，只有节段1包含一个与正粘病毒科流感病毒C的PB1亚基有弱序列同源性的ORF，苏国茂等通过生物信息学分析，认为TiLV基因组第6节段(S6)编码的是病毒的核蛋白(NP)(苏国茂等，罗非鱼湖病毒核蛋白的克隆表达、抗体制备及其组织分布.水产学报，2020，44(2):276-288)。而其他8个节段与已知的病毒没有同源性，各基因节段编码的蛋白功能均未知。
技术实现思路
我们通过病毒的纯化、串联质谱分析、蛋白表达与纯化、抗体制备及鉴定、动物免疫评价等研究证实，TiLV的S8基因编码的VP20蛋白为结构蛋白，能诱导免疫动物产生较高效价的特异性抗体，具有良好的免疫原性；针对VP20蛋白的抗体可以特异性识别TiLV病毒，并对该病毒具有较强的中和能力；进一步试验表明，用VP20重组蛋白免疫罗非鱼，可诱导免疫鱼体产生较高的特异性抗体，并能对TiLV强毒株的攻击起到一定的免疫保护作用。因此，，VP20蛋白及其制备的抗体在免疫学诊断试剂盒、治疗性药物和基因工程疫苗开发等方面的具有重要的应用价值。由此，本专利技术的一个目的在于提供一种TiLV的S8基因编码的VP20抗原蛋白，及由其制备得到的多克隆抗体。本专利技术的另一个目的在于提供上述VP20抗原蛋白和抗VP20抗原蛋白抗体在制备罗非鱼湖病毒病基因工程疫苗、治疗性抗体药物或制备免疫学诊断试剂盒中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种罗非鱼湖病毒S8基因编码的VP20蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。一种编码权利要求1所述VP20蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。上述的VP20蛋白作为罗非鱼湖病毒抗原蛋白的应用。上述多克隆抗体，其特征在于，是以氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的蛋白为抗原，免疫小鼠制备所得。上述VP20蛋白在制备罗非鱼湖病毒基因工程疫苗中的应用。上述VP20蛋白或上述的抗VP20蛋白的多克隆抗体在制备罗非鱼湖病毒免疫学诊断试剂盒上的应用。一种基因工程疫苗，含有上述的VP20蛋白。一种检测罗非鱼湖病毒的免疫学诊断试剂盒或检测试纸条，其含有上述的VP20蛋白。一种检测罗非鱼湖病毒的试剂盒或检测试纸条，其含有所述的多克隆抗体或上述的抗VP20蛋白的抗体。一种可以治疗罗非鱼湖病毒病的治疗性抗体，含有上述权利要求的抗VP20蛋白抗体。本专利技术的有益效果是：TiLV一种高度传染性的烈性病毒，感染该病毒可导致罗非鱼死亡率高达70％-90％，给罗非鱼养殖业造成巨大的经济损失和威胁。目前，针对此疫病还没有任何有效的防控措施和产品。由于为一种新发疫病和病原，其基础研究也较为薄弱，对该病毒的抗原蛋白还完全未知。本专利技术通过多种分子生物学和免疫学技术，筛选、鉴定并表达获得的VP20重组蛋白具有较好的免疫原性，能诱导免疫动物产生较高效价的特异性抗体，且该特异性抗体具有较强的病毒中和活性，能中和病毒使其使其感染性。因此，以抗VP20的抗体可以作为罗非鱼湖病毒病的一种治疗性药物。以VP20蛋白免疫罗非鱼，可诱导罗非产生较高的特异性抗体，并能对TiLV强毒株的攻击起到较好的免疫保护效果(保护率为77.2％)。因此，S8基因编码的VP20蛋白是研制罗非鱼湖病毒病基因工程疫苗较好的候选抗原。以VP20蛋白作为包被抗原建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)可以用来检测TiLV抗体效价，能很好的识别TiLV感染或疫苗免疫罗非鱼产生的特异性抗体；借助间接免疫荧光方法、western-blot、免疫组织化学法等方法，利用抗VP20抗体可以检测罗非鱼组织和细胞中TiLV病毒感染情况。因此，本专利技术的TiLVS8基因及其编码蛋白，对开发罗非鱼湖病毒病新型疫苗、免疫学检测试剂盒及治疗产品具有重要的意义，为罗非鱼湖病毒病提供有效的解决途径。附图说明图1为western-blot检测抗S4、S7、S8和S10基因编码蛋白抗体与TiLV的免疫学反应结果；图2为IFA检测抗S4、S7、S8和S10基因编码蛋白抗体与TiLV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种罗非鱼湖病毒S8基因编码的VP20蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种罗非鱼湖病毒S8基因编码的VP20蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.一种编码权利要求1所述VP20蛋白的核酸分子。


3.根据权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


4.权利要求1所述的VP20蛋白作为罗非鱼湖病毒抗原蛋白的应用。


5.一种多克隆抗体，其特征在于，是以氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的蛋白为抗原，免疫小鼠制备所得。


6.权利要求1所述的VP20蛋白和/或权利要求5所述的多克...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾伟伟，王庆，王英英，于辉，李华，杨映，陈言峰，刘羽鸿，余莹英，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东;44