一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用，基于重组杆状病毒昆虫细胞培养系统，分别构建了表达H7N9高致病性禽流感病毒HA蛋白、NA蛋白、M1蛋白的重组杆状病毒。将三株重组杆状病毒共感染悬浮的昆虫细胞，可收获到在细胞内自行组装的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒。经超滤管与不同梯度浓度蔗糖浓缩纯化后，与佐剂混和乳化制备疫苗。制备的疫苗免疫鸡可诱导机体产生特异性抗体，具有免疫原性强、安全性好、遗传稳定性高等优点。以致死剂量的H7N9亚型高致病性禽流感病毒攻击后，能够提供完全的临床保护且显著抑制鸡的排毒。本发明专利技术为预防H7N9亚型禽流感病毒感染提供了一种新的方法，也为流感病毒新型疫苗的开发奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用
本专利技术属于疫苗
，具体涉及一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用。
技术介绍
禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)属于A型流感病毒，是一种具有8节段的单股负链的RNA病毒，它可引起一种或多种禽类和其它动物发病和死亡。2013年，H7N9亚型禽流感首次在中国长三角地区出现，迄今已在我国人群中形成了五波流行高峰，对公共卫生和家禽养殖造成了重大威胁。在第五波流行中发现，在连接HA1和HA2肽区的裂解位点插入四个碱性氨基酸残基(KRKRTAR/G或KGKRIAR/G)，多个氨基酸的存在证明H7N9AIV已经从LPAI病毒进化为HPAI病毒，为H7N9的防控带来了更大的困难。接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效手段。家禽的疫苗接种对于减少家禽的带毒排毒及降低人群对H7N9病毒的暴露风险有重要意义。目前商品化的H7N9禽流感疫苗为灭活疫苗，在疫病防控上起到了较好的作用。但是，传统灭活疫苗依赖于鸡胚进行生产，具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒，其特征在于，含有A/Chicken/Guangdong/GD15/2016（GD15株）的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和基质M1蛋白；/nA/Chicken/Guangdong/GD15/2016（GD15株）的genebank公开序列号为: PB2(KY751288)、PB1(KY751256)、PA(KY751233)、HA(KY751058)、NP(KY751157)、NA(KY751124)、M(KY751091)、NS(KY751190)。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒，其特征在于，含有A/Chicken/Guangdong/GD15/2016（GD15株）的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和基质M1蛋白；
A/Chicken/Guangdong/GD15/2016（GD15株）的genebank公开序列号为:PB2(KY751288)、PB1(KY751256)、PA(KY751233)、HA(KY751058)、NP(KY751157)、NA(KY751124)、M(KY751091)、NS(KY751190)。


2.根据权利要求1所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒，其特征在于，所述HA蛋白由SEQIDNO：1所示序列或其简并序列编码；NA蛋白由SEQIDNO：2所示序列或其简并序列编码；M1蛋白由SEQIDNO：3所示序列或其简并序列编码。


3.权利要求1或2所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：通过HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒、M1基因重组杆状病毒共同感染悬浮的昆虫细胞，自行组装后收获上清经浓缩纯化处理制备而成。


4.根据权利要求3所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：将HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒、M1基因重组杆状病毒按照MOI为1：1：1共感染昆虫细胞，培养后收集细胞上清，收获同时含有HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒。


5.根据权利要求3或4所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒、M1基因重组杆状病毒为分别构建含有H7N9禽流感病毒的HA/NA/M1基因的重组杆状病毒穿梭质粒，与杆状病毒DNA共同转染昆虫细胞制备形成；
其中，HA基因重组杆状病毒的制备方法，包括：
根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016（GD15株）的HA基因SEQIDNO：1设计引物，HA基因的上游引物序列如SEQIDNO.4所示，HA基因的下游引物序列如SEQIDNO.5所示；利用HA基因的上游和下游引物序列进行RT-PCR扩增；
将扩增后的HA基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得HA基因重组杆状病毒穿梭质粒；
用HA基因重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，拯救获得HA基因重组杆状病毒；将成功拯救的HA基因重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，制得HA基因重组杆状病毒；
和/或，NA基因重组杆状病毒的制备方法，包括：
根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016（GD15株）的NA基因SEQIDNO：2设计引...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡娇，刘秀梵，李如梦，李军，胡增垒，王晓泉，顾敏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32