使用重组短芽孢杆菌属细菌的重组蛋白质制造方法技术

本发明专利技术提供一种重组蛋白质的制造方法，该方法能够使以在菌体内稳定地保持有质粒的状态进行培养时的菌体的增殖速度增加，使重组蛋白质的生产量得到提高。本发明专利技术提供的重组蛋白质的制造方法包括：在32℃以上对具有编码重组蛋白质的基因的短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及在上述高温培养工序之后在低于32℃下对上述短芽孢杆菌属细菌进行培养的低温培养工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用重组微生物的重组蛋白质制造方法。
技术介绍
使用重组微生物的重组蛋白质生产工艺可以用于各种异源蛋白质的制造(非专利文献1)。为了提高重组蛋白质的生产率，对各种培养条件进行了研究，为了提高每单位时间的生产率，增加菌体增殖速度是有效的方法。已知通常只要在能够繁殖微生物的范围内，则培养温度越高，菌体的增殖速度越大。但是对于重组微生物而言，如果培养温度较高，则用于表达异源蛋白质而导入的质粒难以稳定地保持在菌体内，容易从菌体脱落，即使菌体快速增殖，重组蛋白质的生产量也会降低。另一方面，如果培养温度低，则可以稳定地保持质粒，但该情况下菌体增殖速度降低，生产率下降。然而，在使用基因重组技术生产的蛋白质医药品当中，对抗体医药品的需求在迅速扩大。抗体医药品的制造中通常使用具有抗体结合能力的亲和层析法，最常使用利用了抗体纯化用载体的层析法，所述抗体纯化用载体是将蛋白A、蛋白G及蛋白L等蛋白质固定于适当的树脂而得到的。作为具有抗体结合能力的配体，特别多使用蛋白A。作为医药品制造用物资，对以蛋白质作为配体的亲和载体要求较高的品质。对由蛋白质制成的配体自身也要求与蛋白质医药品相同水平的品质，生产成本高，因此处于无法廉价地提供亲和载体的情况。在抗体医药品的制造成本中，亲和载体的生产成本所占的比例较大，成为对降低抗体医药品制造成本的较大限制。因此，希望以高品质廉价地供应由蛋白质制成的配体的方法。本专利技术人等到目前为止发现了如下方法：为了稳定且大量地生产蛋白A的部分序列，发现使用短芽孢杆菌属细菌可在宿主中高效大量地分泌蛋白A的部分序列，使其稳定地积蓄在培养液中，能够容易地以高纯度分离回收(专利文献1)。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第06/004067号非专利文献非专利文献1：KayTerpe.ApplMicrobaiolBiotechnol72：211-222(2006)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术提供一种重组蛋白质的制造方法，该方法在使用短芽孢杆菌属细菌制造重组蛋白质时，能够使在菌体内稳定地保持有质粒的状态下培养时的菌体增殖速度加快，可以使重组蛋白质的生产量得到提高。解决课题的方法本专利技术人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果令人惊讶地发现，通过组合在培养前半阶段以高温进行培养的高温培养工序和在培养后半阶段以更低温度进行培养的低温培养工序，能够以使质粒稳定地保持于菌体内的状态使短芽孢杆菌属细菌的菌体增殖速度加快，使重组蛋白质的生产量提高，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及重组蛋白质的制造方法，该方法包括：在32℃以上对具有编码重组蛋白质的基因的短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及在所述高温培养工序之后在低于32℃下对所述短芽孢杆菌属细菌进行培养的低温培养工序。从高温培养工序向低温培养工序的转换优选在短芽孢杆菌属细菌繁殖过程中的对数生长期初期至中期之间进行。重组蛋白质优选为抗体结合性蛋白质。抗体结合性蛋白质优选为蛋白A的E结构域、D结构域、A结构域、B结构域或C结构域、蛋白G的C结构域或D结构域、蛋白L的B结构域、或者它们的连接体或功能突变体。重组蛋白质优选为生理活性蛋白质。生理活性蛋白质优选为肽类激素或其前体。重组蛋白质优选为抗体或抗体样分子。专利技术的效果根据本专利技术，在使用短芽孢杆菌属细菌的重组蛋白质制造中，能够以将质粒稳定地保持于菌体内的状态使菌体的增殖速度加快，可以抑制成本且使重组蛋白质的生产量提高。本专利技术的方法能够扩大至工业规模。附图说明图1是表达质粒Spa’-pNK3260的示意图。图2是编码Spa’-pNK3260所包含的启动子、夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)(SD)序列、信号肽及蛋白A(SPA’)的DNA碱基序列。具体实施方式本专利技术涉及重组蛋白质的制造方法，该方法包括：在32℃以上对具有编码重组蛋白质的基因的短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及在所述高温培养工序之后在低于32℃下对所述短芽孢杆菌属细菌进行培养的低温培养工序。作为重组蛋白质，可以列举例如：抗体结合性蛋白质、抗体、抗体样分子、酶、其它有用生理活性蛋白质。抗体结合性蛋白质是能够与抗体的抗原识别部位以外的部分(例如，Fc部分)结合的蛋白质。只要是能够与抗体的抗原识别部位以外的部分结合的蛋白质即可，对其结构没有特别限定。作为这样的蛋白质，可以列举例如：蛋白A的E结构域、D结构域、A结构域、B结构域或C结构域、蛋白G的C结构域或D结构域、蛋白L的B结构域、或者它们的连接体或功能突变体。蛋白A是由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生产的细胞壁蛋白质中的1种，是具有约42,000分子量的蛋白质。其结构由7个功能结构域(从氨基末端起：信号序列S、免疫球蛋白结合结构域E、免疫球蛋白结合结构域D、免疫球蛋白结合结构域A、免疫球蛋白结合结构域B、免疫球蛋白结合结构域C、金黄色葡萄球菌细菌细胞壁结合结构域X)构成(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1983,80：697-701、Gene,1987,58：283-295、J.Bio.Chem.,1984,259：1695-1702)。已知对蛋白A的免疫球蛋白结合结构域的相对亲和性取决于pH、金黄色葡萄球菌菌株种类(Infec.Immun.,1987,55：843-847)、免疫球蛋白的类型(IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)及亚型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)等多种因素，在免疫球蛋白的类型中，特别显示出与人IgG1、人IgG2、人IgG4及小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3的Fc部分的强结合性。作为蛋白A的E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域，可以列举分别具有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5所示的氨基酸序列的蛋白质。蛋白G是由C群和G群链球菌属(Streptococcus)细菌生产的细胞壁蛋白质中的1种，是具有约59,000分子量的蛋白质。其结构由5个功能结构域(从氨基末端起：信号序列SS、由序列A和B的重复而形成的白蛋白结合结构域、由序列C和D的重复而形成的免疫球蛋白结合结构域、跨细胞壁结构域W、跨细胞膜结构域M)构成。与蛋白A的免疫球蛋白结合结构域相比，蛋白G的免疫球蛋白结合结构域显示出广泛地与哺乳动物IgG的Fc部分结合性(J.Immunol.,1984,133：969-974、J.Biol.Chem.,1991,266：399-405)。作为蛋白G的C结构域或D结构域，可以列举分别具有序列号6、序列号7、序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质。蛋白L是由大消化链球菌(Peptostreptococcusmagnus)生产的蛋白质中的1种，是具有约79,000分子量的蛋白质。其结构由6个功能结构域(从氨基末端起：信号序列SS、氨基末端结构域A、5次重复免疫球蛋白结合结构域B、2次重复功能不明确的结构域C、跨细胞壁结构域W、跨细胞膜结构域M)构成。该蛋白L的免疫球蛋白结合结构域显示与免疫球蛋白的κ轻链结合性。(J.Biol.Chem.,1989,264：19740-19746、J.Biol.Chem.,1992,267：12820本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组蛋白质的制造方法，该方法包括：在32℃以上对具有编码重组蛋白质的基因的短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及在所述高温培养工序之后在低于32℃下对所述短芽孢杆菌属细菌进行培养的低温培养工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.09 JP 2014-1188171.一种重组蛋白质的制造方法，该方法包括：在32℃以上对具有编码重组蛋白质的基因的短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及在所述高温培养工序之后在低于32℃下对所述短芽孢杆菌属细菌进行培养的低温培养工序。2.根据权利要求1所述的重组蛋白质的制造方法，其中，从高温培养工序向低温培养工序的转换在短芽孢杆菌属细菌繁殖过程中的对数生长期初期至中期之间进行。3.根据权利要求1或2所述的重组蛋白质的制造方...

【专利技术属性】
技术研发人员：金丸博幸，武居辉明，小田原修，土馆健幸，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：日本;JP