尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株及其应用制造技术

本发明专利技术提供经突变筛选后得到的尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株MSA1和MSA5；其保藏编号分别为CGMCC No.13864和CGMCC No.13866，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明专利技术通过筛选出不合成淀粉或者淀粉合成量极少的淀粉合成缺陷突变体，从这些备选突变体中找出既能异养又能光合自养的品种，最后选出在异养培养下生长速率快，生物量多且光合自养条件下合成中性油脂和三酰甘油多的淀粉合成缺陷突变体。最终获得的突变株MSA1、MSA5在异养发酵条件下，可快速积累总脂肪酸含量，淀粉产量大幅降低，最终发酵结果，总脂肪酸含量相对于野生型提高5倍～10倍。大幅提高了碳源转化成油脂转化率，可作为工业级别的“产油微藻”，广泛应用于制备生物柴油。

【技术实现步骤摘要】
尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株及其应用
本专利技术涉及能源微藻优势藻株的突变株筛选领域，尤其涉及尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株，筛选方法及其应用。
技术介绍
目前能源物质，化石燃料如煤、石油的利用率是不可持续性的，同时燃烧化石燃料会导致大量的温室气体排放，是导致全球气候变暖的主要因素。这与我国党中央所倡导的可持续绿色发展是相违背的。因此，找到一个能够再生的绿色的替代物是紧迫的，是迫在眉睫的。微藻，应运而生的成为维持经济和环境的第三产业可持续发展的能源载体。尖状栅藻隶属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、栅藻科、栅藻属。栅藻在高光逆境胁迫诱导下如：缺营养、缺氮、高盐环境下会生产中性脂肪酸和三酰甘油(TAG)。能够广泛应用于饲料和食品生产行业，但随着人们越来越关注环境污染和绿色可持续发展问题。现越来越倾向与对微藻的研究开发和利用。已有相关文献记载尖状栅藻在缺氮的环境下可以积累超过干重45％的三酰甘油(TAG)。同时在此条件下也会有超过干重38％的淀粉积累，淀粉的积累同样也是对碳源的捕获。油脂是由长链三酰甘油所组成并且和淀粉一起作为能源储存物质储存在微藻机体中[1].现已报道非生物胁迫因子，如：盐胁迫、氧化胁迫、或者缺N、P、S和Mg都会导致微藻快速积累油脂和淀粉。Fan等人[2]研究发现，在缺氮条件下，油脂和淀粉积累最多。微藻中的三酰甘油和膜脂的合成起始于叶绿体上denovo总脂的合成(这种合成方式和高等植物相类似)，关于叶绿体中的油脂和淀粉合成代谢途径大致可以分为3条，其中有两条是关于油脂合成的代谢途径，一条是关于淀粉合成代谢的途径。在缺氮条件下，油脂和淀粉合成不仅会竞争环境中的碳源而且还会竞争叶绿体上能容纳的有限空间(在衣藻中叶绿体占细胞总体积的40％)。在高光缺氮诱导条件下，微藻优先利用环境中的碳源合成淀粉，若有多余碳源，微藻才会合成油脂。因此，若能阻断淀粉合成的代谢途径，使环境中的碳源更多的流入油脂代谢途径，这样油脂就会快速积累。因此，淀粉合成缺陷突变株应运而生。目前，用于商业化生产油脂的栅藻多为经筛选得到的GT-2品种，产品中油脂的含量非常有限，从而导致油脂的大规模培养一直处在初级阶段，不能实现绿色环保的可持续发展，利用生物技术对栅藻进行遗传育种改良是目前提高油脂产出的最有效的手段，因此传统的诱变育种方法(物理诱变、化学诱变、生物诱变)被应用与栅藻的育种改良中。例如，jaeger等人[3]用传统的物理诱变(紫外线)方法得到了总脂含量(占干重比)高于GT-2栅藻16％的淀粉突变株slm1.刘玉等人[4]利用传统的生物诱变(转基因技术)的方法将人工DGAT1基因导入到四尾栅藻中获得了一种高油脂的含量的四尾栅藻。微藻产油安全性高，可操作性强，反应条件温和，能充分利用环境中的二氧化碳和太阳能产油、其应用领域广泛，包括废水的净化，蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸等物质的生产。具有操作简单，低成本等优点。现阶段国内利用微藻产油的研究相对较少，尤其是淀粉合成缺陷突变株的研究更少。
技术实现思路
本专利技术的首要技术目的是提供经筛选后得到的尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株，其由于合成淀粉的相关通路部分或者少部分受阻，淀粉含量显著降低，造成合成油脂的速率明显加快，细胞内最高油脂含量显著提升。本专利技术优选通过化学试剂甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulfonate，EMS)诱变并经高通量筛选淀粉突变株的方法来获得高产油脂突变株。筛选出生长速率快、生物量高，油脂积累多的淀粉合成缺陷突变株。本专利技术首先提供一种高通量筛选尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株的方法，所述方法包括：a)构建突变株库：将尖状栅藻的野生株或起始株经诱变处理得到突变株库；b)高光诱导：在多孔板中培养经诱变处理的野生株或起始株的单克隆藻株，再从孔板的各孔中分别提取适量藻液点到缺氮的已经做好位置标记的固体培养基上，在高光下诱导培养；c)用碘颗粒升华的蒸汽熏固体培养基上的单克隆藻株，将没有颜色变化的单克隆藻株通过其所在的位置标记，追溯到孔板的相应位置查找潜在的合成淀粉缺陷型突变株；d)将淀粉含量低于野生株或起始株的单克隆藻株鉴定为淀粉合成缺陷型的尖状栅藻突变株。本专利技术提供的筛选方法具有高通量、无需专门设备、操作性强的特点，可广泛用于尖状栅藻合成淀粉缺陷株的筛选，可在大规模的突变株库中，快速准确地将所需的合成淀粉缺陷株筛选出来，目的性强且高效。在一个优选实施方式中，本专利技术的筛选方法还包括，步骤e)重复步骤c)、d)，以确定突变株的可靠性；或者还选择性地包括：步骤f)测定突变株在37℃恒温异养培养2天至细胞到对数中晚期时，突变株细胞中淀粉的含量值。步骤a)中，一种诱变处理的方式是：确定尖状栅藻的野生株或起始株的萌发率，确定以甲基磺酸乙酯作为诱变剂对尖状栅藻处理时，产生半致死率的诱变剂浓度和处理时间，确定诱变条件，以该确定的诱变条件对尖状栅藻的野生株或起始株进行化学诱变处理；优选地，其中诱变条件是1％的甲基磺酸乙酯处理4小时。根据上述筛选方法，本专利技术在现有尖状栅藻(Chlorellasorokiniana)藻株GT-2(市售菌株，可从中国科学院水生生物研究所藻种库购买得到)基础上，对其诱变筛选出不合成淀粉或者淀粉合成量极少的淀粉合成缺陷突变株，从这些备选突变株中找出既能异养又能光合自养的品种，最后选出在异养培养下生长速率快，生物量多且光合自养条件下合成中性油脂和三酰甘油多的淀粉合成缺陷突变株。经在高光缺氮诱导培养下，淀粉合成缺陷突变株(％干重)能够提高中性油脂和三酰甘油含量，突变株具有淀粉含量低，总脂和TAG含量高的特点。所述突变株在高密度异养发酵条件下，淀粉产量远远低于野生型尖状栅藻，而总脂肪酸含量和油脂产率远高于野生型尖状栅藻。在一些实施方式中，根据本专利技术的方法获得的尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株，其细胞内淀粉含量相对于野生型降低30％～50％，总脂肪酸含量相对于野生型提高5倍～10倍。本专利技术的突变株，在37℃恒温异养培养2天至细胞到对数中晚期时，突变株细胞中淀粉的含量值小于等于5％，总脂肪酸含量大于等于14％，三酰基甘油脂含量在5％～3％。本专利技术的突变株，在37℃恒温异养培养2天至细胞到对数中晚期后，在1/16N的BG11培养基光强300～600μmolm-2s-1条件下高光诱导第2天油脂产率即达到60mg/L/d。本专利技术进一步将筛选获得的尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株MSA1、MSA5进行保藏，命名为尖状栅藻(Scenedesmusacuminaus)GT-2-MSA1、GT-2-MSA5，其保藏编号分别为CGMCCNo.13864、CGMCCNo.13866，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，此二突变株后续简称为MSA1、MSA5。在另一方面，本专利技术还提供了尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株在制备生物柴油中的应用。在另一方面，本专利技术还提供一种产油的方法，其是通过培养所述的尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株，并分离培养产物中的油脂。异养培养所述的尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株的方法，包括如下步骤：一级培养：挑选单克隆突变藻藻株，在Endol液体培养基下活化2天；二级培养：待细胞生长进入生长对数期时，在温度为37℃的摇瓶中培养至第3天；三级培养：加入新鲜的Endol培养基，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量筛选尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株的方法，所述方法包括步骤：a)构建突变株库：尖状栅藻的野生株或起始株经诱变处理得到突变株库；b)高光诱导：在多孔板中培养经诱变处理的野生株或起始株的单克隆藻株，再从孔板的各孔中分别提取适量藻液点到缺氮的已经做好位置标记的固体培养基上，在高光下诱导培养；c)用碘颗粒升华的蒸汽熏固体培养基上的单克隆藻株，将没有颜色变化的单克隆藻株通过其所在的位置标记，追溯到孔板的相应位置查找潜在的合成淀粉缺陷型突变株；d)将淀粉含量低于野生株或起始株的单克隆藻株鉴定为淀粉合成缺陷型的尖状栅藻突变株。

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株的方法，所述方法包括步骤：a)构建突变株库：尖状栅藻的野生株或起始株经诱变处理得到突变株库；b)高光诱导：在多孔板中培养经诱变处理的野生株或起始株的单克隆藻株，再从孔板的各孔中分别提取适量藻液点到缺氮的已经做好位置标记的固体培养基上，在高光下诱导培养；c)用碘颗粒升华的蒸汽熏固体培养基上的单克隆藻株，将没有颜色变化的单克隆藻株通过其所在的位置标记，追溯到孔板的相应位置查找潜在的合成淀粉缺陷型突变株；d)将淀粉含量低于野生株或起始株的单克隆藻株鉴定为淀粉合成缺陷型的尖状栅藻突变株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述尖状栅藻的野生株是尖状栅藻(Scenedesmusacuminaus)藻株GT-2。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其还包括步骤：e)重复步骤b)、c)，确定突变株的可靠性；或者还选择性地包括：f)测定突变株在37℃恒温异养培养2天至细胞到对数中晚期时，突变株细胞中淀粉的含量值。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述诱变处理是：确定尖状栅藻的野生株或起始株的萌发率，确定以甲基磺酸乙酯作为诱变剂对尖状栅藻处理时，产生半致死率的诱变剂浓度和处理时间，确定诱变条件，以该确定的诱变条件对尖状栅藻的野生株或起始株进行化学诱变处理；优选地，所述诱变条件是1％的甲基磺酸乙酯处理4小时。5.权利要求1-3中任一项的方法获得的尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株。6.根据权利要求5所述的尖状栅藻合成淀粉缺陷型突变株，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩丹翔，孙文超，吴明灿，胡强，
申请(专利权)人：国家开发投资公司，中国电子工程设计院，
类型：发明
国别省市：北京,11