小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法技术

本发明专利技术首先提供金藻CoI基因在作为用于小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用，以及如SEQ ID No.1所示的DNA分子标记和特异性引物；接着提供一种小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法，采用上述的特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR。本发明专利技术的技术效果是找到一种分子标记并设计出特异性引物，可以有效的将金藻在小球藻培养过程中有其他污染原生动物存在的条件下鉴定出来。克服了常规PCR定性检测的不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了试验时间，简化了操作，而且荧光检测的结果由电脑软件分析，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。

QPCR method for rapid quantitative detection of alga in the culture of Chlorella

The invention firstly provides diorateria CoI gene as molecular marker in the application for the rapid detection of qPCR method in the harm of golden algae Chlorella cultivation in, such as SEQ and ID No.1 shows DNA molecular markers and specific primers; then provide rapid detection of qPCR against golden algae Chlorella in culture using specific primers, the genomic DNA samples, treated by fluorescence quantitative PCR. The technical effect of the invention is to find a molecular marker and design specific primers, which can effectively identify the presence of other protozoans under the condition of Chlorella vulgaris cultivation. To overcome the shortcomings of the conventional PCR detection, greatly improve the detection sensitivity and specificity, shorten the test time, simplify the operation, and the fluorescence detection results by computer software analysis, to avoid the pollution caused by the product postprocessing process, compared with the conventional PCR is more objective, sensitive and accurate.

【技术实现步骤摘要】
小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法
本专利技术涉及微生物分子检测
，尤其是涉及在小球藻大规模培养中对金藻进行早期监测的qPCR方法。
技术介绍
金藻是小球藻大规模培养中存在的一种重要污染原生动物，它是一种鞭毛虫-Poterioochromonassp.。该鞭毛虫具有自养与混合营养的特点，极易感染并快速吞噬小球藻，一经感染，可使小球藻大规模培养在2至4天内完全溃败，从而给小球藻的大规模培养带来极大危害。因此对于小球藻培养中存在的金藻的早期监测和分子鉴定方法的确定至关重要。目前对金藻研究多局限于对其进行培养以及其对水华藻种的吞噬习性方面，而对其进行检测方面的研究甚少，只停留在传统的显微镜观察、DNA直接测序及聚合酶链反应(PCR)阶段。传统的形态学观察灵敏度低，在原生动物存在数量很大的前提下才可以完成，并且因为原生动物数量庞大，除了已知的形态学知识外还有很多在形态上相似的物种不能区分，而DNA直接测序及聚合酶链反应(PCR)存在检测效率低，检测结果出现假阳性的现象，也经常会影响对实际情况的判断。并且采用以上三种方法对金藻进行检测的时候，就说明已在显微镜中观察到金藻的存在，而由于金藻细胞个体很小，而显微镜最高的检测效率为1个细胞每微升，也就意味着当显微镜观察金藻已经存在是金藻的细胞密度至少达到了1000个每毫升，而在这个细胞密度下已足以使小球藻大规模培养发生完全溃败。因此，对金藻的早期监测和分子鉴定的方法尤为重要。随着免疫学和分子生物学检测技术的发展，在原生动物的检测手段方面已发展迅速，实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)以其检测速度快，灵敏度高，特异性强的特点在原生动物的分子检测中和贝类病原检测中已得到广泛的应用。在贝类上的原生动物检测灵敏度以达到30拷贝。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了在小球藻培养早期快速监测到污染物的存在，提供一种金藻的荧光定量PCR检测方法。该方法较传统的PCR方法具有更高的灵敏度，且操作简便，可进行大量的样品检测，并对金藻进行定量，从而为小球藻培养早期金藻污染的检测和监控提供有效方法。本专利技术的第一个技术目的是提供金藻CoI基因在作为用于小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用。由于原生动物基因序列相似度较大，如直接采用DNA直接测序及聚合酶链反应(PCR)，经常出现检测效率低，检测结果出现假阳性的现象。而本专利技术经过反复研究后，发现采用CoI基因作为分子标记进行qPCR，可以有效的将金藻在小球藻培养过程中有其他污染原生动物存在的条件下鉴定出来。本专利技术的第二个技术目的是提供一种DNA分子标记，其序列如SEQIDNo.1所示。接着提供一种引物，其可特异性扩增所述的分子标记。引物序列为：上游引物CoI-F：5’-TATATATCATCTTCGGAGCATTCTC-3’，如SEQIDNO.2所示；下游引物CoI-R：5’-TTATTTAGCCTTGGGAACG-3’，如SEQIDNO.3所示。上述分子标记或引物可应用在小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法中。进一步地，本专利技术提供一种小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法，采用上述的特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。该方法较传统的PCR方法具有更高的灵敏度，且操作简便，可进行大量的样品检测，并对金藻进行定量，从而为小球藻培养早期金藻污染的检测和监控提供有效方法。所述的快速定量检测qPCR方法，还包括步骤：采用所述的特异性引物，将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒PGEM-T中，构建的重组质粒PGEMT-CoI作为检测金藻浓度的定量标准品。所述的快速定量检测qPCR方法，其中特异性引物：上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L。荧光定量PCR采用的荧光染料优选为SYBRGreen染料，荧光检测波长为465-510nm。优选的，所述荧光定量PCR的反应体系为：20μl反应体系中包含：2×的LightCycler480SYBRGreenⅠMaster10μl，10μmol/L的上游引物0.5μl，10μmol/L的下游引物0.5μl，DNA模板1μl，加水至总体积20μl。所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃5min，1个循环；95℃10s、62℃20s、72℃30s，40个循环。所述荧光定量PCR，以结果的判断方法如下：1)阳性对照的Ct值应小于33.0，阴性对照的Ct值应大于35.0，阳性模板为质粒定量标准品PGEMT-CoI，阴性模板为无菌双蒸水；2)若Ct值小于33.0，且呈现典型的扩增曲线，则判定为阳性结果，表明检测样品中含有金藻；3)若Ct值大于35.0或无扩增信号，则判定为阴性结果，表明检测样品中无金藻；4)若Ct值在33.0～35.0之间，则视为可疑结果，样品需重复检验一次，若结果仍在此范围内，则判定为阴性结果；5)结果呈阳性的样品，根据其Ct值以及建立的定量标准曲线计算样品内的金藻含量；计算公式如下：样品含金藻的细胞数(cells/ml)＝conc/N，N代表每个细胞中CoI基因的拷贝数。本专利技术最主要的技术效果是找到一种分子标记并设计出特异性引物，可以有效的将金藻在小球藻培养过程中有其他污染原生动物存在的条件下鉴定出来。所采用的荧光定量PCR技术巧妙的利用了PCR技术的DNA高效扩增、特异性引物的高特异性以及光谱技术的敏感性和实时定量的优点，克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了试验时间，简化了实验操作，而且荧光检测的结果由电脑软件分析，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。本专利技术的方法也可设计为金藻早期快速鉴定试剂盒。其具有对样本低要求，高效率，精确检测，省时省力省费用，效果显著等特点。所述试剂盒中包含所述的特异性引物。具体的，所述试剂盒可以包括检测试剂和基因组DNA提取试剂。所述检测试剂包括荧光染料、特异性引物、阳性标准品。所述基因组DNA提取试剂优选包括Roche的HighPureTemplatePreparationKit试剂盒。本专利技术提供的检测方法对金藻的检测具有特异性强、灵敏度高的特点，该方法可检测出的最低浓度分别可达到21copies/μl金藻线粒体CoI基因的存在和0.15cells/μl金藻细胞的存在，并且可以在100000个小球藻细胞中快速检测到1个金藻细胞的存在，对小球藻培养污染物的早期监测具有重要意义。对本专利技术方法的灵敏度、稳定性、特异性以及对环境样品的有效性进行综合评价如下：(1)灵敏度：用灭菌双蒸水分别将质粒定量标准品PGEMT-CoI稀释109、108、107、106、105、104、103、102、101opies/μl，采用经优化后的体系进行检测，验证所建立的方法的灵敏度。本检测方法在102～109copies/reaction数量级范围内具有良好的线性关系，相关系数R2＝0.9974，其检测范围可达到8个数量级，其灵敏度可到100拷贝以下。(2)稳定性：从批间重复和批内重复两个方面进行评价。批内重复性：选取同一份标本，设5个平行反应管同时进行反应，检验其Ct值的变异系数。批间重复性：选取2个本文档来自技高网...

【技术保护点】
金藻CoI基因在作为用于小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用。

【技术特征摘要】
1.金藻CoI基因在作为用于小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用。2.一种DNA分子标记，其序列如SEQIDNo.1所示。3.一种引物，其可特异性扩增权利要求2所述的分子标记。4.根据权利要求3所述的引物，其序列如下：CoI-F：5’-TATATATCATCTTCGGAGCATTCTC-3’；CoI-R：5’-TTATTTAGCCTTGGGAACG-3’。5.权利要求2所述分子标记或权利要求3或4所述引物在小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法中的应用。6.一种小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，采用权利要求3或4所述的特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。7.根据权利要求6所述的小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，还包括步骤：采用所述的特异性引物，将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒PGEM-T中，构建的重组质粒PGEMT-CoI作为检测金藻浓度的定量标准品。8.根据权利要求6所述的小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，所述特异性引物：上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L。9.根据权利要求6所述的小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR采用的荧光染料为SYBRGreen染料，荧光检测波长为465-510nm。10.根据权利要求6所述的小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为：20μl反应体系中包含：2×的LightCycler480SYBRGreenⅠMaster10μl，10μmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚迎春，李焕楠，王贤慧，展雪玲，胡强，
申请(专利权)人：国家开发投资公司，中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11