突变基因的定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种突变基因的定量检测方法，步骤包括：1)提取样本DNA；2)单链合成反应；3)微球捕获纯化；4)微球上的3’端保护性外切纯化反应；5)以步骤4)的产物为模板进行微球上的单链合成反应，分离去除微球；6)3’端保护性外切纯化反应；7)双端接头桥媒连接反应，并纯化；8)以前次纯化产物为模板，反复进行单链合成反应和3’端保护性外切纯化反应；9)定量，测序，判断突变基因。该方法以靶标基因片段为模板进行反复多循环单链合成反应，将原始模板上系列位点的碱基转化为互补序列，使靶标基因序列最大保真地转化合成，经多级单链合成后，获得测序所需的足量完整待测序列，如此提高了低比例突变基因的检测灵敏度和保真度。

Quantitative detection of mutant genes

The invention discloses a method for quantitative detection, a mutation of the gene comprises the following steps: 1) extracting DNA samples; 2) single strand synthesis reaction; 3) microspheres capture and purification; 4) microspheres on the 3 'end of the protective outer cutting purification reaction; 5) to step 4) of the product as the template strand synthesis reaction microspheres the separation of removal of microspheres; 6) 3' end protective cutting purification reaction; 7) double end joint bridge connecting media reaction and purification; 8) before purification products as template, repeated strand synthesis reaction and the 3 'end of the protective outer cutting purification reaction; 9) quantitative sequencing. Determine the mutant gene. The method of repeated single cycle reaction to the target gene fragment as template, the conversion of series of base sites for the complementary sequence of the original template, the target gene sequence maximum fidelity synthesis, single strand through multi-stage synthesis, obtaining sufficient complete sequencing of the desired sequence to be detected, so improve the low proportion of the mutant gene the detection sensitivity and fidelity.

【技术实现步骤摘要】
突变基因的定量检测方法
本专利技术涉及DNA深度测序检测
，特别是涉及组织、血浆或血清中10％～0.05％低比例的靶序列变异位点不确定的DNA片段的高保真深度测序检测。
技术介绍
基因科学是生命科学的一个重要领域，生命体的基因密码序列及其变异会影响生命体的多种生物功能，导致功能变异，通过检测生命体的基因变异可以了解和预估生命的功能变异，通过定量检测生命体的基因变异情况，也可以精确了解患病生命体的疾病进展和预后，例如肿瘤的进展、复发的有无或早中晚期和治疗效果。当前，检测基因变异已成为分析判断遗传疾病，肿瘤情况，个体化药物反应特征的重要手段，用于预测和预防出生缺陷，定期监控肿瘤复发，监控肿瘤个体化用药和化疗的治疗效果。目前，基因变异的检测方法主要有一代测序法、二代测序法和三代测序法。一代测序，只能检测变异在20％以上比例的样品，低于20％，检测的可靠性明显降低，所以不能检测稀有的低比例(1％---0.05％)基因变异型。当前二代测序法(包括基因建库和上机测序两大环节)的高深度测序(大于5000乘)可以检测基因变异型比例低于10％的样品。因为当前的测序建库方法主要有两种，一种是全基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
突变基因的定量检测方法，其特征在于，步骤包括：1)提取样本DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板进行单链合成反应；3)用微球捕获纯化步骤2)的产物；4)在微球上对步骤3)的产物进行3’端保护性外切纯化反应；5)以步骤4)的产物为模板，在微球上进行单链合成反应，然后分离去除微球；6)对步骤5)的产物进行3’端保护性外切纯化反应；7)对步骤6)的产物进行双端接头桥媒连接反应；8)纯化步骤7)的产物；9)以纯化后的产物为模板，进行单链合成反应和3’端保护性外切纯化反应；10)以步骤9)的产物为模板，进行单链合成反应和3’端保护性外切纯化反应；11)参照步骤9)～10)，以前次纯化产物为模板进行单链...

【技术特征摘要】
1.突变基因的定量检测方法，其特征在于，步骤包括：1)提取样本DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板进行单链合成反应；3)用微球捕获纯化步骤2)的产物；4)在微球上对步骤3)的产物进行3’端保护性外切纯化反应；5)以步骤4)的产物为模板，在微球上进行单链合成反应，然后分离去除微球；6)对步骤5)的产物进行3’端保护性外切纯化反应；7)对步骤6)的产物进行双端接头桥媒连接反应；8)纯化步骤7)的产物；9)以纯化后的产物为模板，进行单链合成反应和3’端保护性外切纯化反应；10)以步骤9)的产物为模板，进行单链合成反应和3’端保护性外切纯化反应；11)参照步骤9)～10)，以前次纯化产物为模板进行单链合成反应和3’端保护性外切纯化反应，多次重复，直到产物的量达到二代测序所需的量；12)定量后进行二代测序，根据测序结果判断突变基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，所述单链合成反应的热循环数为40～80个；引物的3’端包含有与靶标互补的特异序列区，5’端包含有公共接头区，且5’端有生物素修饰；所述公共接头区包含有与测序引物序列相同或互补的序列片段。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微球为悬浮微球，微球表面修饰有链霉亲和素。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3’端保护性外切纯化反应是向要纯化的反应物中加入与该反应物3’端序列互补的序列进行DNA杂交，再加外切酶，进行3’端保护性外切纯化反应。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)，所述单链合成反应的热循环数为40～80个；引物的3’端包含有与靶标互补的特异序列区，5’端包含有公共接头区，且5’端有磷酸化修饰；所述公共接头区包含有与测序引物序列相同或互补的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄新华，戴慧清，
申请(专利权)人：上海奥因生物科技研发有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31