捕获、检测和定量小RNA的方法、组合物与试剂盒技术

本发明专利技术提供了用于捕获、检测和定量成熟小RNA的方法、组合物与试剂盒。所述方法的实施例包括通过将一个5'连接衔接子连接至5'端并且使3'端聚腺苷酸化以对成熟小RNA的5'端和3'端加尾。其他实施例包括通过一个通用反转录引物反转录连接衔接子的聚腺苷酸化成熟小RNA以及通过通用引物扩增cDNA。

Methods, compositions and kits for capturing, detecting and quantiting small RNA

The present invention provides a method, a composition and a kit for capturing, detecting and quantificationally mature small RNA. The embodiments of the method include connecting a 5'connection child to the 5' end and acidifying the 3'end polyadenosine to tail the 5' end and the 3'end of the mature small RNA. Other examples include polyadenylation of the small RNA and the amplification of cDNA through universal primers through a universal reverse transcriptional primer reverse transcriptional connection.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】捕获、检测和定量小RNA的方法、组合物与试剂盒相关申请的交叉引用本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2015年3月13日提交的美国临时专利申请No.62/133,185的权益，该美国临时专利申请的全部内容完整并入本文作为参考。
本教导内容涉及分子及细胞生物学领域，具体地涉及检测目标多核苷酸诸如小RNA种类的领域。引言小分子、非编码调控RNA种类诸如微小RNA(miRNA)是一系列丰富的调控元件，已被证明影响植物和动物正常细胞过程的各个方面，包括细胞死亡、分化和增殖。miRNA还涉及许多疾病，包括癌症、心脏病和神经疾病，因此，miRNA被作为诊断和预后生物标志物进行研究。包括miRNA在内的小RNA通过特异性酶复合物由较大的RNA前体产生。一般来讲，成熟miRNA由一段包含20-30个核苷酸的高度保守的核心序列组成，并且通常具有一种5'-末端单磷酸酯和一个3'-末端羟基基团。miRNA通常通过结合至目标mRNA的所述3'-UTR内的靶位点来诱导基因沉默。此交互作用抑制蛋白质合成和/或引发mRNA降解。检测、定量和分析成熟小RNA诸如miRNA的尝试受到过若干因素的阻碍，其中包括小RNA较小的尺寸以及相关但不同种类之间的相似性。密切相关的miRNA家族成员可能只有一个核苷酸存在差异，因此需要高特异性和区分单一核苷酸错配的能力。核酸微阵列法已被用于定量成熟小RNA，但是此方法需要高浓度的输入标靶以实现高效杂交。尽管所述较大的前体可以通过PCR进行扩增，但成熟小RNA的所述较小的尺寸妨碍了通过定量或反转录酶聚合酶链反应(PCR)对其进行扩增。已开发出有利于成熟小RNA的PCR扩增的方法。例如，通过添加至少一个寡核苷酸衔接子延长成熟小RNA。仍然需要一种捕获、检测和分析小RNA的方法，在关于下列属性中的至少一者上改善现有技术：灵敏度、速度、效率和成本效益。专利技术概述本文提供了用于捕获和检测成熟小RNA的方法、组合物与试剂盒。在某些实施例中，本教导内容提供了用于从样本中捕获、检测和定量成熟小RNA诸如微小RNA(miRNA)的方法，该方法包括使所述RNA的3'端聚腺苷酸化、将单链通用衔接子连接至所述RNA的5'端，以及通过通用反转录(RT)引物反转录所述连接衔接子的聚腺苷酸化RNA。所得的反转录产物包含所述成熟小RNA的cDNA以及连接的衔接子，该连接的衔接子在所述5'端具有通用RT引物。此cDNA产物可被捕获和/或检测，或使用添加至所述5'端和3'端两者的通用序列，可使用单配对通用正向和反向引物对cDNA产物进行通用预扩增和/或扩增。在此类扩增反应后，可捕获和/或检测基于所述成熟小RNA的扩增子。在某些实施例中，该目标成熟小RNA为一个miRNA。在某些实施例中，本文提供了一种用于检测成熟小RNA的方法，该方法包括：对于包含成熟小RNA的样本，使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化并且在单链RNA连接酶存在下将一个单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端以形成一个RNA连接产物，其中该衔接子包含一个通用正向引物部分；使用一个反转录(RT)引物反转录所述RNA连接产物以形成该RNA连接产物的一个cDNA产物，其中该RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分并且该尾巴部分包含一个通用反向引物部分；使用一组第一正向和反向引物对扩增所述cDNA产物以形成一个扩增产物，其中所述第一正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物。在某些实施例中，本教导内容提供了一种用于检测成熟小RNA的方法，该方法包括：对于包含一个成熟小RNA的样本，使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化并且在单链RNA连接酶存在下将一个单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端以形成一个RNA连接产物，其中该衔接子包含一个通用正向引物部分；使用一个反转录(RT)引物反转录所述RNA连接产物以形成所述RNA连接产物的cDNA产物，其中该RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分并且该尾巴部分包含一个通用反向引物部分；使用一组第一正向和反向引物对预扩增所述cDNA产物以形成一个扩增产物，其中所述第一正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及通过qPCR检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物，其中该qPCR包含一组第二正向和反向引物对，其中所述第二正向引物和第二反向引物中的至少一者包含特异于所述成熟小RNA的一个部分。在某些实施例中，可使用封闭剂。所述目标多核苷酸的检测可使用诸如所述聚合酶链反应(PCR)等扩增方法进行，所述PCR方法例如定量实时PCR、定量终点PCR和标准PCR。在某些实施例中，所述扩增方法包括使用多磷酸分解作用(APP)反应和多磷酸分解试剂进行活化。在某些实施例中，本文提供了试剂盒，该试剂盒包含：一个单链衔接子，该单链衔接子包含一个3'末端–OH基团和一个通用正向引物部分；一个反转录(RT)引物，其中该RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分并且其中该尾巴部分包含一个通用反向引物部分；一种单链RNA连接酶；以及一种反转录酶。在某些实施例中，所述反转录酶为一种热启动反转录酶。在某些实施例中，所述试剂盒还包含一种DNA聚合酶以及一个通用正向和反向引物对，其中该通用正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且该通用反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交。在某些实施例中，提供了组合物诸如反应组合物，该组合物包含：一个单链衔接子，该单链衔接子包含一个3'末端–OH基团和一个通用正向引物部分；一个反转录(RT)引物，其中该RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分并且其中该尾巴部分包含一个通用反向引物部分；一种poly(A)聚合酶；一种单链RNA连接酶；以及一种反转录酶。在某些实施例中，组合物还包含一个成熟小RNA的cDNA，该cDNA包含位于所述5'端的RT引物序列和位于所述3'端的衔接子序列。某些实施例提供了使用本文所公开的任何方法来鉴定和/或确认可用于疾病检测和监控、治疗选择和监控以及患者诊断和/或预后方法的成熟小RNA生物标志物。附图简略说明本领域的技术人员将理解，下文描述的附图仅用于举例说明的目的。所述附图并不旨在以任何方式限制本教导内容的范围。图1示意性示出根据本教导内容实施例中一者的两端通用加尾成熟小RNA测定的工作流程。图2A和2B以图形方式示出根据本教导内容实施例之方法的线性动态范围(图2A)和灵敏度(图2B)。图3以图形方式示出在各种输入RNA量范围下采用预扩增(PA)和不用预扩增(RT)的48次miRNA测定的平均灵敏度之比较。NTC为无模板对照物。图4以图形方式示出用于检测来自脑部的总RNA制剂中miRNA之测定方法的灵敏度比较。检测方法：TaqManTMIndividualMicroRNA测定(金标)；根据本教导内容实施例包含(+PA)和不含(-PA)一个预扩增步骤的两端通用加尾miRNA测定。图5A-5D以图形方式示出根据本教导内容实施例的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测一个成熟小RNA的方法，所述方法包括：提供包含一个成熟小RNA的样本；使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化，并且在单链RNA连接酶存在的状态下将一个单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端，由此形成一个RNA连接产物，其中所述衔接子包含一个通用正向引物部分；使用一个反转录(RT)引物反转录所述RNA的连接产物，从而形成所述RNA连接产物的一个cDNA产物，其中所述RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分，而所述尾巴部分包含一个通用反向引物部分；使用一组第一正向和反向引物对扩增所述cDNA产物以形成一个扩增产物，其中所述第一正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)检测对应于所述成熟小RNA的所述扩增产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.13 US 62/133,1851.一种用于检测一个成熟小RNA的方法，所述方法包括：提供包含一个成熟小RNA的样本；使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化，并且在单链RNA连接酶存在的状态下将一个单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端，由此形成一个RNA连接产物，其中所述衔接子包含一个通用正向引物部分；使用一个反转录(RT)引物反转录所述RNA的连接产物，从而形成所述RNA连接产物的一个cDNA产物，其中所述RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分，而所述尾巴部分包含一个通用反向引物部分；使用一组第一正向和反向引物对扩增所述cDNA产物以形成一个扩增产物，其中所述第一正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)检测对应于所述成熟小RNA的所述扩增产物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述cDNA产物扩增为一个预扩增步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述预扩增步骤包含2至14个扩增循环。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包含使用一个标记的检测器探针的qPCR，而所述检测器探针包含特异于所述成熟小RNA的一个部分。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包含使用一组第二正向和反向引物对的qPCR，而所述第二正向引物和第二反向引物中的至少一者包含特异于所述成熟小RNA的一个部分。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚腺苷酸化、连接、反转录和扩增步骤在不干扰所述反应产物之纯化的情况下进行。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚腺苷酸化步骤在所述连接步骤之前进行。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接步骤在所述聚腺苷酸化步骤之前进行。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述反转录步骤和所述预扩增步骤在所述相同反应容器中基本上同时进行。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接步骤和反转录步骤在相同反应容器中基本上同时进行。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接步骤、反转录步骤和扩增步骤在相同反应容器中基本上同时进行。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述成熟小RNA选自由一个微小RNA(miRNA)、一个短干扰RNA(siRNA)、一个重复序列相关siRNA(rasiRNA)、一个反式作用siRNA(tasiRNA)、一个Piwi交互作用RNA(piRNA)、一个短发夹RNA(shRNA)和一个21-URNA所组成的组。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含一个成熟小RNA的样本选自由一种单独制备的总RNA、一种细胞提取物、一个完整细胞、一种体外转录反应和一种化学合成所组成的组。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含一个成熟小RNA的样本由生物组织、全血、血清、血浆和尿液组成的组来制备。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子为一个RNA分子。16.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述连接和/或扩增步骤中增加一个封闭寡核苷酸。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸选自由一个3'-MGB封闭寡核苷酸、一个5'-MGB封闭寡核苷酸、一个2'-O-甲基封闭寡核苷酸、一个3'-吖啶封闭寡核苷酸、一个5'-吖啶封闭寡核苷酸、一个STAR封闭寡核苷酸和包含一段poly(A)序列的一个封闭寡核苷酸所组成的组。18.一种用于检测一个成熟小RNA的方法，所述方法包括：提供包含一个成熟小RNA的样本；使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化，并且在单链RNA连接酶存在的状态下将一个单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端，由此形成一个RNA连接产物，其中所述衔接子包含一个通用正向引物部分；使用一个反转录(RT)引物反转录所述RNA连接产物，从而形成所述RNA连接产物的一个cDNA产物，其中所述RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分，而所述尾巴部分包含一个通用反向引物部分；使用一组第一正向和反向引物对预扩增所...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·刘，S·董，L·黄，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US