底数大于2的指数核酸扩增制造技术

本文描述了提供高效核酸扩增的方法和组合物。在一些实施方案中，这允许每个扩增循环的扩增产物的大于2倍的增加，并因此相对于常规PCR提高了灵敏度和速度。

More than 2 of the amplified nucleic acid base index

This article describes a method and composition for providing efficient nucleic acid amplification. In some embodiments, this allows the amplification product of each amplification loop to increase more than 2 times, and therefore improves sensitivity and speed relative to the conventional PCR.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】底数大于2的指数核酸扩增相关申请的交叉引用本申请要求于2014年12月15日提交的美国临时申请No.62/092,102的权益，所述临时申请以引用的方式全文纳入本文。在联邦资助的研究和开发下做出的关于专利技术权利的声明不适用。
本文所述的方法和组合物通常涉及核酸扩增领域。特别地，本文所述为用于增大扩增效率的方法和组合物。
技术介绍
多种核酸扩增方法是可获得的，并且许多方法已用于实现基于核酸检测的灵敏诊断测定。聚合酶链式反应(PCR)仍然是最广泛使用的DNA扩增和定量方法。巢式PCR、两步PCR用于增大PCR的特异性和灵敏度(美国专利No.4,683,195)。用于PCR扩增的巢式引物为具有与靶序列上反向引物和正向引物靶向位点之间的区域互补的序列的寡核苷酸。然而，PCR通常具有若干限制。PCR扩增在每个循环仅能够实现靶序列量的少于两倍的增加。这仍然是相对较低的。此外，该方法的灵敏度通常受限，使其难以在单个反应中检测仅以少数分子存在的靶标。
技术实现思路
本文描述了基于使用新引物(例如，新的内引物)的方法和组合物，所述新引物被设计以使在扩增后产生的扩增子中维持外引物结合位点。本文提供了以下实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包括至少两种第一引物形式的或能够形成至少两种第一引物的寡核苷酸，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少两种第一引物包括第一外引物和第一内引物，所述第一外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a；并且所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含引物序列a，其邻近于并且是单链引物序列b的5’；和夹序列c，其邻近于并且是...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.15 US 62/092,1021.一个用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包括至少两种第一引物形式的或能够形成至少两种第一引物的寡核苷酸，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少两种第一引物包括第一外引物和第一内引物，所述第一外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a；并且所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含引物序列a，其邻近于并且是单链引物序列b的5’；和夹序列c，其邻近于并且是引物序列a的5’，其中夹序列c不与第一链模板序列d’互补，所述序列d’邻近于并且是第一链模板序列a’的3’。2.权利要求1的引物组，其中所述引物组额外地包括至少一种第二引物，所述第二引物能够与所述第二模板链特异性杂交。3.一种扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述方法包括：(a)使所述样品与以下接触：(i)至少两种能够与所述第一模板链杂交的第一引物，其中所述至少两种第一引物包括第一外引物和第一内引物，所述第一外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a；并且所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含引物序列a，其邻近于并且是单链引物序列b的5’；和夹序列c，其邻近于并且是引物序列a的5’，其中夹序列c不与第一链模板序列d’互补，所述序列d’邻近于并且是第一链模板序列a’的3’；和(ii)至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物，其中，如果存在，所述接触在其中引物退火至它们的模板链的条件下进行；以及(b)在发生链置换的条件下，如果存在，使用使用缺少5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶扩增靶核酸以产生扩增子，所述扩增子包含从模板序列a’延伸至所述第二引物结合位点的序列。4.任一前述权利要求的引物组或方法，其中所述DNA聚合酶包含链置换活性。5.任一前述权利要求的引物组或方法，其中双链形式的结合序列c-a的Tm大于双链形式的结合序列a-b的Tm。6.任一前述权利要求的引物组或方法，其中结合序列c-a比结合序列a-b更富含GC和/或包含更多稳定的碱基。7.权利要求3-6的方法，其中所述扩增在PCR的指数期中以最高达3循环数的速率扩增靶核酸。8.权利要求3-7的方法，其中所述扩增允许在比仅使用单一正向引物和单一反向引物的所述检测所需的扩增循环少约12％-42％的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸。9.权利要求1、2、5或6的引物组或权利要求3-8的方法，其中所述第二引物包括至少两种第二引物形式的或能够形成至少两种第二引物的寡核苷酸，所述第二引物能够与所述第二模板链杂交，其中所述至少两种第二引物包括第二外引物和第二内引物，所述第二外引物包含与第二模板链序列e’特异性杂交的引物序列e；并且所述第二内引物包含与第二模板链序列f’特异性杂交的单链引物序列f，其中f’邻近于并且是e’的5’，并且其中单链引物序列f在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含引物序列e，其邻近于并且是单链引物序列f的5’；和夹序列g，其邻近于并且是引物序列e的5’，其中夹序列g不与第二链模板序列h’互补，所述序列h’邻近于并且是第二链模板序列e’的3’。10.权利要求9的引物组或方法，其中双链形式的结合序列g-e的Tm大于双链形式的结合序列e-f的Tm。11.权利要求9或10的引物组或方法，其中结合序列g-e比结合序列e-f更富含GC和/或包含更多稳定的碱基。12.权利要求9-11的引物组或方法，其中所述扩增在PCR的指数期中以最高达6循环数的速率扩增靶核酸。13.权利要求9-12的引物组或方法，其中所述扩增允许在比仅使用单一正向引物和单一反向引物的所述检测所需的扩增循环少约36％-66％的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸。14.任一前述权利要求的引物组或方法，其中夹序列c和g，如果存在，不能在扩增过程中被复制。15.权利要求14的引物组或方法，其中夹序列c和/或g，如果存在，包含2’-O-甲基RNA。16.任一前述权利要求的引物组或方法，其中所述第一内引物和/或如果存在，所述第二内引物，其双链引物序列不包含发夹序列。17.权利要求3-15的引物组或方法，其中所述第一内引物的双链引物序列包含发夹序列，在该发夹序列中夹序列c连接至互补序列c’，和/或所述第二内引物，如果存在，其双链引物序列包含发夹序列，在该发夹序列中夹序列g连接至互补序列g’。18.一个用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包括至少三种第一引物形式的或能够形成至少三种第一引物的寡核苷酸，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少三种第一引物包括第一外引物、第一中间引物和第一内引物，所述第一外引物包含与第一模板链序列d’特异性杂交的引物序列d；所述第一中间引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a，其中a’邻近于并且是d’的5’，并且其中单链引物序列a在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含：引物序列d，其邻近于并且是单链引物序列a的5’；和夹序列c1，其邻近于并且是引物序列d的5’，其中夹序列c1不与第一链模板序列i’互补，该模板序列i’邻近于并且是第一链模板序列d’的3’；并且所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含：引物序列a，其邻近于并且是单链引物序列b的5’；引物序列d，其邻近于并且是引物序列a的5’；和夹序列c2，其邻近于并且是引物序列d的5’，其中夹序列c2不与第一链模板序列i’互补。19.权利要求18的引物组，其中所述引物组还包括至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物。20.一种扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·希古奇，
申请(专利权)人：塞弗德公司，
类型：发明
国别省市：美国,US