基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法技术

一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、检测试剂盒和方法。引物组包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物；试剂盒包括引物液、反应液、Bst DNA聚合酶、错配结合蛋白、显色剂和对照。检测方法是通过提取待检DNA，利用具有链置换活性的DNA聚合酶活性，采用四条特异性引物及一种错配结合蛋白，在63℃对样品DNA模板进行扩增，可检测到DNA的pg级，其鉴定方式是采用在反应体系中加入

【技术实现步骤摘要】
基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
沙门氏菌是一种常见、重要的人兽共患病原菌，在公共卫生学上具有重要意义。沙门氏菌是主要的肠道致病菌，易引起食物中毒。在我国，以沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位。目前对食品中的沙门氏菌检测手段仍采用常规生物学培养鉴定法辅以抗原和抗体的免疫学检测技术，病原微生物分离培养、生理生化鉴定、血清分型和免疫酶等表型特征检测方法，常规方法繁琐、耗时耗力，不能满足日益发展的需要。因此，为有效地预防和控制疾病发生，建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。但这些检测技术对检测人员技术水平要求高，并且这些技术需要的检测仪器昂贵、检测周期长，难以实现快速检测推广的目的。所以，在食品检测和科学研究实践中均需要一种降低操作技术和费用、快速简便、容易普及、安全可靠的检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所解决的技术问题在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组。本专利技术所解决的技术问题还在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒。本专利技术所解决的技术问题还在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一方面，本专利技术公开了一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:FP引物：TTTATATATATATAAAGTTATTGGCGATAGCCTP引物：AGCCTGGCGGTTGGACCACGGTGACAATAGBP引物：GGTTTTGTTGTCTTOP1引物：CGCCACGTTCGGGCAATTOP2引物：TTTGGTAATAACGATAAA。优选地，扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。另一方面，本专利技术还公开了一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，该检测试剂盒中含有上述方案中所列的智能恒温扩增引物组。优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒中，其引物中TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。优选地，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述错配结合蛋白为TapMuts错配结合蛋白。优选地，所述智能恒温扩增反应液含有：28mMdNTPs、10％DMSO、40mMTris-HCl(pH8.8)、20mMKCl、20mM(NH4)2SO4、16mMMgSO4，0.2％20。优选地，阳性对照为含有沙门氏菌invA基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含沙门氏菌invA基因片段的水或其他溶剂。更优地，阴性对照为去离子水。优选地，所述显色剂为1/50000原液稀释的GreenI。再有，本专利技术还公开了一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：(1)待检样品DNA的提取；(2)智能恒温扩增反应：将步骤(1)中提取的待检样品DNA加入智能恒温扩增反应体系中，混匀后离心，并于63℃反应20-40min；该智能恒温扩增反应体系中含有上述方案中所述的智能恒温扩增引物组；(3)结果判断：通过观察ESE-tubescanner扩增仪的扩增曲线判断扩增结果。优选地，所用智能恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl22.5mmol/L、KCl10mmol/L、MgSO42mmol/L、GreenI0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl20mmol/L、0.2％20、6UBstDNA聚合酶、1μgTapMuts、1μL步骤(1)中提取的待检样品DNA，用去离子水补齐到25μL。本专利技术的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的方法可以通过本专利技术方案中的所公开的智能恒温扩增检测试剂盒得以实施，也可以采用基于本专利技术的原理和设计思路采用其他类似智能恒温扩增检测试剂盒得以实现。从原理上讲，本专利技术以智能恒温扩增技术为依托，开发一种可快速鉴别沙门氏菌的引物组、试剂盒和方法。智能恒温扩增技术的基本原理，即获取目标序列后在等温条件下对其反复进行扩增，并通过荧光实时监测，以检测目标序列的存在。该试剂盒摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求，检测仪器低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点，同时就该方法可适用于其他菌群的快速鉴定。因此，结合上述原理及本专利技术实施例中的技术效果可知，本专利技术至少包含如下有益效果：本专利技术根据目标序列保守区域设计turnbaekprimer(TP)、forwardprimer(FP)、boostprimer(BP)、outerprimer1(OP1)、outerprimer2(OP2)共5条引物，TP由退火序列和一段能够与目标序列互补的核苷酸序列构成，FP带有一个茎环结构，它们的退火位点分别位于目标序列的两端，可分别从两端与互补的2条DNA单链退火，向对侧延伸。OP1和OP2的退火位点分别位于TP和FP外侧，向中间退火延伸的同时将TP和FP延伸得到的双链剥离。带有TP或FP的单链被置换下来后又可作为模板，继续上述过程，如此可形成2种关键的单链中间产物，这2种中间产物继而分别以TP和FP的特殊结构为起点，进行自身引导的DNA合成。这样循环往复，在聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增。在此过程中，其中一条引物上结合一种杂交敏感的荧光引物，一旦与互补序列退火杂交，即可发出一定强度的荧光，由实时荧光定量PCR仪监测。随着扩增反应的进行，荧光强度增大，当超过检测最低I值时即可确定扩增反应的实现，也即目标序列的存在。整个过程在63℃恒温条件下30-40min即可完成。智能恒温扩增技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异，成为单核苷酸多态性检测的有力方法。这也是与其他等温扩增技术，如环介导恒温扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、解链酶扩增等相比，智能恒温扩增最为明显的优点，这些传统的恒温扩增无法识别DNA片段中的突变点而难以实现基因多态性的检测，而阻碍了恒温扩增技术在基因多态性检测领域的推广。另外，智能恒温扩增技术与传统的检测基因多态性的方法，如DNA芯片、限制性片段长度多态性PCR、等位基因特异性多PCR，DNA测序，TaqMan探针、Invader等相比，其主要优势在于恒温反应这一特性决定了智能恒温扩增法无需昂贵操作仪器，具有简单、快速、成本低、灵敏度高等明显优势。相比于其他检测技术，本专利技术技术具有快速、精确、灵敏、特异、背景低、成本低等优点，并摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求束缚，具有检测仪器价格低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点。具体而言：(1)检测时间短：在20-40mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:FP引物：TTTATATATATATAAAGTTATTGGCGATAGCCTP引物：AGCCTGGCGGTTGGACCACGGTGACAATAGBP引物：GGTTTTGTTGTCTTOP1引物：CGCCACGTTCGGGCAATTOP2引物：TTTGGTAATAACGATAAA。

【技术特征摘要】
1.一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:FP引物：TTTATATATATATAAAGTTATTGGCGATAGCCTP引物：AGCCTGGCGGTTGGACCACGGTGACAATAGBP引物：GGTTTTGTTGTCTTOP1引物：CGCCACGTTCGGGCAATTOP2引物：TTTGGTAATAACGATAAA。2.如权利要求1所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组，其特征在于：扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。3.一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒中含有如权利要求1或2所述的智能恒温扩增引物组。4.根据权利要求3所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。5.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述错配结合蛋白为TapMuts错配结合蛋白。6.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述智能恒温扩增反应液含有：28mMdNTPs、10％DMSO、40mMTris-HCl(pH8.8)、20mMKCl、20mM(NH4)2SO4、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶蕾，石磊，闫鹤，陈洵，常彦磊，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44