用于快速筛查EGFR基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于快速筛查EGFR基因外显子18‑21突变的特异性引物及其应用方法，包括以下步骤：(1)提取外周血样品基因组DNA；(2)设计合成用于扩增EGFR基因外显子18‑21的特异性引物共4对；(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR；(4)曲线分析中得到阳性结果的样本，即发生EGFR基因突变。本发明专利技术的检测方法不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。同时针对人群快速筛查，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点。

【技术实现步骤摘要】
用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物及应用
本专利技术涉及基因工程
尤其是涉及一种用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物及其应用。
技术介绍
近年来，我国恶性肿瘤的发生率和病死率呈明显上升趋势，已跃居我国居民死亡病因的首位。然而，对于恶性肿瘤的早期发现、早期诊断以及防治，尚无突破性研究，部分患者就诊时已处于中晚期，疗效较差。因此，提高恶性肿瘤的早期诊断水平，是改善恶性肿瘤诊治疗效的有效出路。目前临床上，多采用血清学检测的方法监测血清或其他体液中的肿瘤标志物，动态地对肿瘤的存在、发生发展及预后做出判断。然而，任何一种科学指标都不是绝对的。肿瘤标志物的器官特异性和肿瘤特异性较差,既存在于肿瘤中也存在于正常人群和非肿瘤患者血液和体液中,每个人对于肿瘤标志物都有各自的基础水平,不能单凭超过参考范围而进行诊断。有时要借助相关辅助检查,对检测结果进行仔细分析后,才能提高对肿瘤的存在、发展及预后的实用价值。同时，肿瘤标志物浓度会受到体内代谢的很多因素影响，所以准确性也会受到影响。以肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)为例，除绝大多数肝癌病人的血清呈阳性外，还有31％～52％的急性肝炎、15％～58％的慢性肝炎以及11％～47％的肝硬化病人的AFP也会有大幅上升，因此不必一看到“阳性”就“色变”。当然，与此同时，甲胎蛋白阴性自感不适的患者也不能掉以轻心，还要依靠大夫联合多项检查直至细胞学、病理学检查等做进一步查实和鉴别。基因是具有遗传效应的DNA片段，支持着生命的基本构造和性能。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。无论是碱基置换突变还是移码突变，都能使多肽链中的氨基酸组成或顺序发生改变，进而影响蛋白质或酶的生物功能，使机体的表型出现异常。因此，对基因的突变进行检测，能够在疾病发生的早期阶段被检测出，有利于实现疾病的早发现，早诊断，早治疗。HRM(高分辨率熔解曲线分析)是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。美中不足的是在进行未知突变筛查、扫描时，只能检测到有无突变，无法确定突变在DNA片段中位置。触底PCR(Touchdown(TD)PCR)是一种特殊技术，只需要做一次正式实验，就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的，绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)属于酪氨酸激酶受体，它介导的信号转导途径调节细胞的生长、增殖和分化。EGFR表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一条是PI3K/Akt/mTOR通路。在癌症中发现EGFR酪氨酸激酶区常发生各种突变,这些突变和酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关。EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21外显子，其中19和21号外显子突变覆盖突变的90％。外显子19的缺失和外显子21的替代突变，与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的敏感性密切相关。另外，大部分对EGFR-TKI治疗有效地患者最终都会对EGFR-TKI产生耐药性，而EGFR外显子20的体细胞突变是EGFR-TKI激发耐药的主要机制之一。外显子20的突变类型主要是T790M。这一突变仅见于药物治疗后复发者，突变使得非小细胞肺癌患者对吉非替尼和厄洛替尼出现激发耐药。因此，EGFR突变的检测对健康人群体检筛查、早期发现癌症或者癌症的个体化治疗具有重要的参考价值。
技术实现思路
本专利技术的技术目的首先是提供一种用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物，其结合高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR方法，可以快速筛查EGFR基因外显子18-21是否发生突变，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点，尤其适用于大量人群的快速筛查需求，如健康人群的体检需求。其可以指示EGFR基因外显子18-21已经突变病变，再通过基因测序法进一步确定突变的具体位置及序列，准确率高，具有极高的实用性价值。所述用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物的核苷酸序列分别是：进一步地，本专利技术提供一种快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的体外检测方法，其不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。同时针对人群快速筛查，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点。所述检测方法是采用上述的特异性引物，进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR。优选的步骤包括：(1)提取外周血样品基因组DNA；(2)合成用于扩增EGFR基因外显子18-21的特异性引物共4对；(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR，95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用分析软件对采集后的曲线进行分析；(4)HRM曲线分析：如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生EGFR基因突变。例如附图1中箭头所示，相对于阴性对照出现一个单独的峰，为阳性结果，可以表明存在EGFR基因突变。所述特异性引物，是针对EGFR基因外显子18-21特别设计的引物，经过反复试验筛选和验证，最终筛选得到，具有特异性强、扩增效率高等优点。所述步骤(3)中PCR的反应体系优选的是：总体积为15μL的反应体系包含：mastermix10μL；MgCl22.4μL；GCenhancer0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其余为RNasefreeH2O。反应时，向所述反应体系中依次加入样品基因组DNA5μL、阴性对照、空白对照进行触底PCR反应，其中阴性对照是EGFR野生型序列，空白对照是无DNA模板。本专利技术的检测方法，还有一个明显的技术特征是，所述步骤(1)中外周血样品采用干血片收集。只需要0.5mL的外周血即可，对于待检者来说，具有可长途运输、保存时间长、采血简单等优点，是基因检测技术中一项重大的改进。同时步骤(1)中样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于快速筛查EGFR基因外显子18‑21突变的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列分别是：EGFR外显子18正向引物：如SEQ ID No.1所示；EGFR外显子18反向引物：如SEQ ID No.2所示；EGFR外显子19正向引物：如SEQ ID No.3所示；EGFR外显子19反向引物：如SEQ ID No.4所示；EGFR外显子20正向引物：如SEQ ID No.5所示；EGFR外显子20反向引物：如SEQ ID No.6所示；EGFR外显子21正向引物：如SEQ ID No.7所示；EGFR外显子21反向引物：如SEQ ID No.8所示。

【技术特征摘要】
1.用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列分别是：EGFR外显子18正向引物：如SEQIDNo.1所示；EGFR外显子18反向引物：如SEQIDNo.2所示；EGFR外显子19正向引物：如SEQIDNo.3所示；EGFR外显子19反向引物：如SEQIDNo.4所示；EGFR外显子20正向引物：如SEQIDNo.5所示；EGFR外显子20反向引物：如SEQIDNo.6所示；EGFR外显子21正向引物：如SEQIDNo.7所示；EGFR外显子21反向引物：如SEQIDNo.8所示。2.权利要求1所述的特异性引物用于高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR方法快速筛查EGFR基因外显子18-21突变。3.一种快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的特异性引物，进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：(1)提取外周血样品基因组DNA；(2)合成权利要求1所述的特异性引物共4对；(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR，95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾瀚，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：北京青航基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11