判定胎儿的基因状态的方法技术

本发明专利技术提供一种判定胎儿的基因状态的方法，其具备：目的区域选择工序，从人类基因组上的区域选择用于判定基因状态的目的区域；从母血试样分离单细胞的工序；从单细胞提取基因组DNA的工序；将从单细胞提取的基因组DNA作为模板，利用以对目的区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合，对目的区域进行PCR扩增的工序；及DNA测序工序，解读目的区域的PCR扩增产物的DNA碱基序列，以对目的区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具有基于局部比对评分的第1阶段选拔工序及基于全局比对评分的第2阶段选拔工序。

A method of determining the gene state of a fetus

The present invention provides a method to determine fetal gene status with its objective selection process, for the purpose of choosing regional determination gene status from the human genome region; single cell isolation procedure from maternal blood samples; genomic DNA was extracted from single cell process; the extraction of genomic DNA from single cells as a template, using primers for PCR amplification of the combination design way of objective region, PCR amplification process of objective region; and DNA sequencing procedures, DNA sequence amplification product to interpretation of regional PCR design method to design objective region primer combination PCR amplification by means of primer combinations for the polymerase chain reaction, the design method has first stages based on the local alignment score selection process and score based on the global alignment of second stage selection Pull out the process.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】判定胎儿的基因状态的方法
本专利技术涉及一种判定胎儿的基因状态的方法。
技术介绍
作为产前诊断，以往一直进行通过羊膜穿刺检查羊水中的胎儿细胞的染色体的羊水检查。但是，该方法中，存在流产的可能性，作为较大的问题而被指出。作为安全的产前诊断，最近通过分析母体血液中与母亲的无细胞DNA(Deoxyribonucleicacid：脱氧核糖核酸)混合存在的来源于胎儿的无细胞DNA的方法进行产前诊断。该方法为无创性，作为能够以较高概率获取胎儿的遗传信息的方法而受到关注。专利文献1中，记载有用于利用根据来源于胎儿母亲的DNA与来源于胎儿的DNA的混合试样测定出的基因型数据及根据需要利用来自母亲及父亲的基因型数据来确定妊娠中的胎儿的染色体的倍数性状态的方法。另一方面，得知胎儿细胞在母体的血液中移动，该胎儿细胞与血液一同在母体中循环。如果能够再现性良好且可靠地分析这种胎儿细胞中的基因组DNA，则能够实现无流产可能性的安全而且直接分析来源于胎儿的DNA的产前诊断。但是，理解到存在于母体的血液中的胎儿细胞(例如，胎儿有核红细胞)在母血数mL中仅存在1个左右，由此研究有各种可靠地获取胎儿细胞的方法。利用这种公知的技术可靠地分选稀少的胎儿细胞时可获得的胎儿细胞的数量至多为数个，或者有时仅限于1个。关于扩增细胞中的DNA的扩增技术，专利文献1中记载有利用多个引物组合，通过多重PCR(PolymeraseChainReaction：聚合酶连锁反应)扩增多个感兴趣的基因位点，检测突变及染色体异常等基因疾病的方法。并且，专利文献2中公开有使用高度多重目标化聚合酶连锁反应扩增来源于胎儿的基因组DNA的特定序列，通过序定器确定各目标基因座上的等位基因频率的方法。作为通过1个反应系统同时扩增2个以上的扩增对象区域的反应，已知有多重PCR。已知多重PCR为对根据自微量血液提取的少量DNA有效地对扩增对象区域进行扩增来分型多个SNPs(SingleNucleotidePolymorphisms：单核苷酸多态性)有用的技术。专利文献3中公开有能够有效地扩增多个扩增部位(目标)的多重PCR用的引物设计方法。以往技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2003/074723专利文献2：国际公开第2012/108920专利文献3：国际公开第2008/004691
技术实现思路
专利技术要解决的技术课题为了分离来源于胎儿的有核红细胞，利用公知的技术分析所获取的细胞中的DNA来判定胎儿的基因状态，需从单细胞提取DNA并进行扩增至分析所需的量，进行全基因组扩增的情况较多。但是，全基因组扩增虽然具有使从一个细胞提取的微量的基因组DNA飞跃性地增加的优点，但也有根据扩增区域，难以将扩增倍率保持为恒定，通过扩增PCR产物被偏置这样的缺点。因此，要求即使进行全基因组扩增，也可将从单细胞提取的基因组DNA作为模板均匀且高精度地进行目的区域的PCR扩增的判定胎儿的基因状态的方法。因此，本专利技术的课题在于，提供一种可均匀且高精度地进行目的区域的基于聚合酶连锁反应(PCR：PolymeraseChainReaction)的扩增的判定胎儿的基因状态的方法。用于解决技术课题的手段本专利技术人等为了解决上述课题而反复进行深入研究，其结果，发现如下内容并完成了本专利技术：对引物二聚体形成性进行评价，对引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含引物的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分，根据所求出的局部比对评分进行第1阶段的选拔，对包含引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分，根据所求出的全局比对评分进行第2阶段的选拔，若采用在第1阶段及第2段階的任一阶段中均被选拔的引物，则能够获得选择性且有效地扩增目标基因区域的供聚合酶连锁反应的引物组合。即，本专利技术为以下(1)至(6)。(1)一种判定胎儿的基因状态的方法，其具备：目的区域选择工序，从人类基因组上的区域选择用于判定上述基因状态的目的区域；单细胞分离工序，从母血试样分离单细胞；基因组DNA提取工序，从上述单细胞提取基因组DNA；基于聚合酶连锁反应的扩增工序，将从上述单细胞提取的基因组DNA作为模板，利用以通过聚合酶连锁反应对上述目标区域进行扩增的方式设计的引物组合，通过聚合酶连锁反应对上述目标区域进行扩增；及DNA测序工序，解读上述目的区域的基于聚合酶连锁反应的扩增产物的DNA碱基序列，其中，上述目的区域选择工序在上述单细胞分离工序及上述基因组DNA提取工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述单细胞分离工序及上述基因组DNA提取工序这两个工序同时进行，以通过聚合酶连锁反应对上述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：目标区域选择工序，从上述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的目标区域；引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述目标区域的引物候选的碱基序列；局部比对工序，对上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；第1阶段选拔工序，根据在上述局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；第2阶段选拔工序，根据在上述全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及引物采用工序，采用在上述第1阶段选拔工序及上述第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述目标区域的引物的碱基序列，其中，上述局部比对工序及上述第1阶段选拔工序这两个工序在上述全局比对工序及上述第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述全局比对工序及上述第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。(2)根据上述(1)所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，以通过聚合酶连锁反应对上述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：第1目标区域选择工序，从上述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的第1目标区域；第1引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述第1目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述第1目标区域的引物候选的碱基序列；第1局部比对工序，对上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；第一第1阶段选拔工序，根据在上述第1局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；第1全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；第一第2阶段选拔工序，根据在上述第1全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；第1引物采用工序，采用在上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种判定胎儿的基因状态的方法，其具备：目的区域选择工序，从人类基因组上的区域选择用于判定所述基因状态的目的区域；单细胞分离工序，从母血试样分离单细胞；基因组DNA提取工序，从所述单细胞提取基因组DNA；基于聚合酶连锁反应的扩增工序，将从所述单细胞提取的基因组DNA作为模板，利用以通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合，通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增；及DNA测序工序，解读所述目的区域的基于聚合酶连锁反应的扩增产物的DNA碱基序列，其中，所述目的区域选择工序在所述单细胞分离工序及所述基因组DNA提取工序这两个工序之前或者之后进行，或与所述单细胞分离工序及所述基因组DNA提取工序这两个工序同时进行，以通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：目标区域选择工序，从所述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的目标区域；引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的所述目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增所述目标区域的引物候选的碱基序列；局部比对工序，对所述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含所述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；第1阶段选拔工序，根据在所述局部比对工序中求出的局部比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；全局比对工序，对包含所述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；第2阶段选拔工序，根据在所述全局比对工序中求出的全局比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及引物采用工序，采用在所述第1阶段选拔工序及所述第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增所述目标区域的引物的碱基序列，其中，所述局部比对工序及所述第1阶段选拔工序这两个工序在所述全局比对工序及所述第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与所述全局比对工序及所述第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.31 JP 2015-0743181.一种判定胎儿的基因状态的方法，其具备：目的区域选择工序，从人类基因组上的区域选择用于判定所述基因状态的目的区域；单细胞分离工序，从母血试样分离单细胞；基因组DNA提取工序，从所述单细胞提取基因组DNA；基于聚合酶连锁反应的扩增工序，将从所述单细胞提取的基因组DNA作为模板，利用以通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合，通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增；及DNA测序工序，解读所述目的区域的基于聚合酶连锁反应的扩增产物的DNA碱基序列，其中，所述目的区域选择工序在所述单细胞分离工序及所述基因组DNA提取工序这两个工序之前或者之后进行，或与所述单细胞分离工序及所述基因组DNA提取工序这两个工序同时进行，以通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：目标区域选择工序，从所述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的目标区域；引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的所述目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增所述目标区域的引物候选的碱基序列；局部比对工序，对所述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含所述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；第1阶段选拔工序，根据在所述局部比对工序中求出的局部比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；全局比对工序，对包含所述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；第2阶段选拔工序，根据在所述全局比对工序中求出的全局比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及引物采用工序，采用在所述第1阶段选拔工序及所述第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增所述目标区域的引物的碱基序列，其中，所述局部比对工序及所述第1阶段选拔工序这两个工序在所述全局比对工序及所述第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与所述全局比对工序及所述第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。2.根据权利要求1所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，以通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：第1目标区域选择工序，从所述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的第1目标区域；第1引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的所述第1目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增所述第1目标区域的引物候选的碱基序列；第1局部比对工序，对所述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含所述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；第一第1阶段选拔工序，根据在所述第1局部比对工序中求出的局部比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；第1全局比对工序，对包含所述引物候...

【专利技术属性】
技术研发人员：大内彩，辻本尧之，长濑雅也，石井靖幸，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP