蛋白质的分泌生产方法技术

开发了改善通过棒状细菌的异源蛋白质的分泌生产的新技术，并因此提供了异源蛋白质的分泌生产方法。培养具有异源蛋白质分泌生产能力并已修饰成保持具有特定突变的phoS基因的棒状细菌，以通过分泌生产来生产异源蛋白质。

Production methods of protein secretion

New techniques to improve the production of heterologous proteins through rod like bacteria have been developed, and the production methods of heterologous proteins are provided. A rod-shaped bacterium that has heterologous protein secreting capacity and has been modified to maintain phoS gene with specific mutation is cultured to produce heterologous proteins through secretory production.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质的分泌生产方法专利
本专利技术涉及异源蛋白质的分泌生产的方法。专利技术背景关于通过微生物分泌生产异源蛋白质，已经报道了通过芽孢杆菌细菌(非专利文件1)、甲醇同化酵母、巴斯德毕赤酵母(非专利文件2)、曲霉属的丝状真菌(非专利文件3和4)等分泌生产异源蛋白质。还尝试了通过棒状细菌分泌生产异源蛋白质。关于通过棒状细菌分泌生产异源蛋白质，已经报道了通过谷氨酸棒杆菌(此后也缩写为谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))的核酸酶和脂肪酶的分泌(专利文件1，非专利文件5)，蛋白酶的分泌如枯草杆菌蛋白酶(非专利文件6)，使用棒状细菌的细胞表层蛋白PS1和PS2(也称为CspB)的信号肽的蛋白质的分泌(专利文件2)，使用PS2(CspB)的信号肽的纤连蛋白结合蛋白的分泌(非专利文件7)，使用PS2(CspB)和SlpA(也称为CspA)的信号肽的转谷氨酰胺酶原的分泌(专利文件3)，使用变体型分泌系统的蛋白质的分泌(专利文件4)，通过变体菌株的转谷氨酰胺酶原的分泌(专利文件5)等。另外，作为改善通过棒状细菌的异源蛋白质分泌产量的技术，已知降低细胞表层蛋白的活性(专利文件6和7)，降低青霉素结合蛋白的活性(专利文件6)，增强编码金属肽酶的基因的表达(专利文件7)，将突变导入核糖体蛋白S1基因(专利文件8)，用在信号肽和异源蛋白质之间包含插入的Gln-Glu-Thr的氨基酸序列来表达异源蛋白质，等等。一般的蛋白质分泌途径是从原核生物到真核生物广泛存在的，被称为“Sec系统”的途径，然而，最近在植物细胞叶绿体的类囊体膜中发现了完全不同于Sec系统的蛋白质分泌途径(非专利文件8)。由于精氨酸-精氨酸序列普遍存在于由此分泌的蛋白质的信号序列中，该新的分泌途径被命名为“Tat系统”(双精氨酸易位系统)(非专利文件8)。已知蛋白质在形成高级结构之前的状态下由Sec系统分泌，而在细胞中蛋白质在形成高级结构之后通过Tat系统分泌穿过细胞膜(非专利文件9)。对于棒状细菌，也已经报道了使用Tat依赖性信号肽的蛋白质的分泌生产(专利文件8和10)。作为细菌对细胞内部和外部的各种环境变化的响应的系统，已知称为“双组分调节系统”的信号传导途径。该双组分调节系统是由两个组分组成的调节系统：负责感测环境变化刺激的传感器激酶，和负责接收来自传感器激酶的信号并调节下游基因的表达的响应调节器(regulator)。当传感器激酶感测到刺激时，其特异性组氨酸残基被自磷酸化，通过将磷酸基团转移到响应调节器的特定天冬氨酸残基来转导信号，并从而激活磷酸化的响应调节器以作为转录因子调节下游基因的表达。关于谷氨酸棒杆菌的双组分调节系统的知识详见非专利文件10等。对于谷氨酸棒杆菌，已知至少13个类型的系统作为双组分调节系统。它们中的一个是PhoRS系统，其由传感器激酶PhoS蛋白和响应调节器PhoR蛋白组成。对PhoRS缺陷菌株的分析揭示了PhoRS系统是感测环境中磷酸盐消耗并进行信号转导的调节系统(非专利文件11)。PhoS蛋白是具有两个跨膜结构域的膜蛋白。PhoS蛋白由以下组成：感测刺激的传感器结构域，称为HAMP结构域的连接子结构域、具有自磷酸化的组氨酸残基的HisKA结构域，以及具有ATP结合能力和催化组氨酸残基自磷酸化的功能的HATPase结构域。PhoR蛋白是细胞内蛋白。PhoR蛋白由接收信号的N末端侧接的收器结构域和调节下游基因表达的C末端侧的效应器结构域组成(非专利文件10)。然而，不知道PhoRS系统与异源蛋白质分泌生产之间的关系。也不知道在棒状细菌中PhoS蛋白的突变对于分泌生产异源蛋白质是有效的。此外，不知道PhoS蛋白的特定突变对于分泌生产异源蛋白质是有效的。现有技术参考文献专利文件专利文件1:美国专利号4,965,197专利文件2:日本专利公开(Laid-open)(Kohyo)号6-502548专利文件3:日本专利号4320769专利文件4:日本专利公开(Laid-open)(Kokai)号11-169182专利文件5:日本专利号4362651专利文件6:WO2013/065869专利文件7:WO2013/065772专利文件8:WO2013/118544专利文件9:WO2013/062029专利文件10:日本专利号4730302非专利文件非专利文件1:Microbiol.Rev.,57,109-137(1993)非专利文件2:Biotechnol.,11,905-910(1993)非专利文件3:Biotechnol.,6,1419-1422(1988)非专利文件4:Biotechnol.,9,976-981(1991)非专利文件5:J.Bacteriol.,174,1854-1861(1992)非专利文件6:Appl.Environ.Microbiol.,61,1610-1613(1995)非专利文件7:Appl.Environ.Microbiol.,63,4392-4400(1997)非专利文件8:EMBOJ.,14,2715-2722(1995)非专利文件9:J.Biol.Chem.,25；273(52),34868-74(1998)非专利文件10:Appl.Microbiol.Biotechnol.,94,1131-1150(2012)非专利文件11:J.Bacteriol.,188,724-732(2006)专利技术概述本专利技术要实现的目的本专利技术的目的是开发改善通过棒状细菌的异源蛋白质的分泌生产的新技术，并从而提供使用棒状细菌分泌生产异源蛋白质的方法。实现所述目的的手段为了实现上述目的，本专利技术的专利技术人进行了各种研究。作为结果，他们发现可以通过修饰棒状细菌使得保持具有特定突变的phoS基因来改善棒状杆菌通过分泌生产来产生异源蛋白质的能力，并实现了本专利技术。因此本专利技术可以如下实施。[1]生产异源蛋白质的方法，所述方法包括：培养具有用于分泌表达所述异源蛋白质的遗传构建体的棒状细菌；和收集通过分泌生产所产生的所述异源蛋白质，其中所述棒状细菌已经被修饰成保持编码突变体PhoS蛋白的phoS基因，其中所述突变体PhoS蛋白是具有改善所述异源蛋白质的分泌生产量的突变的PhoS蛋白，其中所述遗传构建体以从5’至3’的方向包含在所述棒状细菌中发挥功能的启动子序列，编码在所述棒状细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，以及编码所述异源蛋白质的核酸序列，并且其中所述异源蛋白质作为与所述信号肽的融合蛋白表达。[2]上述方法，其中所述突变是在野生型PhoS蛋白中用另一氨基酸残基替换除自磷酸化的组氨酸残基以外的氨基酸残基的突变。[3]上述方法，其中所述突变是在野生型PhoS蛋白中用另一氨基酸残基替换除自磷酸化的组氨酸残基以外的HisKA结构域中的氨基酸残基的突变。[4]上述方法，其中所述突变是在野生型PhoS蛋白中用除芳香族氨基酸和组氨酸残基以外的氨基酸残基替换对应于SEQIDNO:4中位置302处的色氨酸残基的氨基酸残基的突变。[5]生产异源蛋白质的方法，所述方法包括：培养具有用于分泌表达所述异源蛋白质的遗传构建体的棒状细菌；和收集通过分泌生产所产生的所述异源蛋白质，其中所述棒状细菌已经被修饰成保持编码突变体PhoS蛋白的phoS基因，其中所述突变体PhoS本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产异源蛋白质的方法，所述方法包括：培养具有用于分泌表达所述异源蛋白质的遗传构建体的棒状细菌；和收集通过分泌生产所产生的所述异源蛋白质，其中所述棒状细菌已经被修饰成保持编码突变体PhoS蛋白的phoS基因，其中所述突变体PhoS蛋白是具有改善所述异源蛋白质的分泌生产量的突变的PhoS蛋白，其中所述遗传构建体以从5’至3’的方向包含在所述棒状细菌中发挥功能的启动子序列，编码在所述棒状细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，以及编码所述异源蛋白质的核酸序列，并且其中所述异源蛋白质作为与所述信号肽的融合蛋白表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.24 JP 2015-0890461.生产异源蛋白质的方法，所述方法包括：培养具有用于分泌表达所述异源蛋白质的遗传构建体的棒状细菌；和收集通过分泌生产所产生的所述异源蛋白质，其中所述棒状细菌已经被修饰成保持编码突变体PhoS蛋白的phoS基因，其中所述突变体PhoS蛋白是具有改善所述异源蛋白质的分泌生产量的突变的PhoS蛋白，其中所述遗传构建体以从5’至3’的方向包含在所述棒状细菌中发挥功能的启动子序列，编码在所述棒状细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，以及编码所述异源蛋白质的核酸序列，并且其中所述异源蛋白质作为与所述信号肽的融合蛋白表达。2.根据权利要求1的方法，其中所述突变是在野生型PhoS蛋白中用另一氨基酸残基替换除自磷酸化的组氨酸残基以外的氨基酸残基的突变。3.根据权利要求1的方法，其中所述突变是在野生型PhoS蛋白中用另一氨基酸残基替换除自磷酸化的组氨酸残基以外的HisKA结构域中的氨基酸残基的突变。4.根据权利要求1的方法，其中所述突变是在野生型PhoS蛋白中用除芳香族氨基酸和组氨酸残基以外的氨基酸残基替换对应于SEQIDNO:4中位置302处的色氨酸残基的氨基酸残基的突变。5.生产异源蛋白质的方法，所述方法包括：培养具有用于分泌表达所述异源蛋白质的遗传构建体的棒状细菌；和收集通过分泌生产所产生的所述异源蛋白质，其中所述棒状细菌已经被修饰成保持编码突变体PhoS蛋白的phoS基因，其中所述突变体PhoS蛋白是具有以下突变的PhoS蛋白，所述突变是在野生型PhoS蛋白中用除芳香族氨基酸和组氨酸残基以外的氨基酸残基替换对应于SEQIDNO:4中位置302处的色氨酸残基的氨基酸残基的突变，其中所述遗传构建体以从5’至3’的方向包含在所述棒状细菌中发挥功能的启动子序列，编码在所述棒状细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，以及编码所述异源蛋白质的核酸序列，并且其中所述异源蛋白质作为与所述信号肽的融合蛋白表达。6.根据权利要求4或5的方法，其中所述除芳香族氨基酸和组氨酸残基以外的氨基酸残基是赖氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、丝氨酸残基、半胱氨酸残基、甲硫氨酸残基、天冬氨酸残基，或天冬酰胺残基。7.根据权利要求2至6中任一项的方法，其中所述野生型PhoS蛋白是下述(a)，(b)，或(c)中定义的蛋白质：(a)包含SEQIDNO:4，54，55，56，57，或58的氨基酸序列的蛋白质；(b)包含SEQIDNO:4，54，55，56，57，或58的氨基酸序列，但其包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入，或添加的蛋白质；(c)包含与SEQIDNO:4，54，55，56，57，或58的氨基酸序列显示90％或更高同一性的氨基酸序列的蛋白质。8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述信号肽是Tat依赖性信号肽。9.根据权利要求8的方法，其中所述Tat依赖性信号肽选自下组：TorA信号肽、SufI信号肽、PhoD信号肽、LipA信号肽，和IMD信号肽。10.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：松田吉彦，伊藤悠美，鹿岛由香里，山田奈绪子，鹤井典子，板屋宽，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP