单链DNA产物的调制方法技术

本发明专利技术的目的在于：提供一种即使在临床现场等进行简易的检查也可以获得正确的结果的高精度的单链DNA的调制方法的技术。本发明专利技术提供一种以通过连接反应、优选循环连接反应扩增的单链核苷酸产物为检测样品而不进行PCR或LCR扩增，由此也可以用于更简易且迅速的基因分析的高精度的单链DNA产物。

The modulation method of single strand DNA products

The purpose of the invention is to provide a high precision single chain DNA modulation method, which can also get the correct results even in clinical field and so on. The invention provides a single strand PCR product with high accuracy, which can be used to detect samples without amplification of LCR or DNA, and can also be used for simple and rapid gene analysis.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单链DNA产物的调制方法
本专利技术涉及用于基因检查的、将单链DNA通过连接反应、特别是循环连接反应(CLR)进行扩增的技术。
技术介绍
分析样本(検体)的核苷酸序列(塩基配列)再进行判定的基因检查在基础研究、医疗、食品等领域广泛应用。更具体而言，其用于检测突变、判定基因多态性(在人或动物中是指变化频率为1%以上的基因)、检测病原菌、检查是否存在基因重组等。例如，认为基因多态性的判定可以事先预测药物的副作用或效果，从而在医疗现场等中开始有效运用。基因检查典型的是利用使用了实时PCR设备的TaqMan法或QP法、使用了DNA微阵列的方法(DigiTag法等)等来进行。但是，这些方法均需要技术学习、高价的荧光检测设备，因此虽然进行了委托分析，但在医疗现场等难以有效运用，这是现状。另外，公开了在固定有寡核苷酸的固相上检测靶核酸的方法(专利文献1、专利文献2)。这里所说的“固相”是指想要使寡核苷酸在硝酸纤维素膜或尼龙膜等可固定寡核苷酸的膜上结合成线条状或斑点状的所谓“条带”，具体例子有被称作PAS(PrintedArrayStrip，印刷阵列条带)的条带。根据核酸层析法的原理，将通过PCR调制的DNA产物在该条带上展开，通过杂交可进行检测。在该方法中，调制的DNA产物具有以下特征：形成双链，在其DNA产物的一条链的末端添加单一标签。但是，由于是通过PCR扩增靶双链DNA序列，因此虽然灵敏度(反应性)高，但存在着以下问题：容易产生引物二聚体等非特异性扩增产物，精度(准确性)低。为了在临床现场等简易地进行基因分析，有必要提供即使通过这样的简易的方法也能够检测的、高精度的核酸样品的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利5503021号；专利文献2：国际公开第2012/070618号；专利文献3：日本专利3103806号；专利文献4：日本特开2006-101844号；专利文献5：日本特公平6-36760号；专利文献6：日本专利3330599号。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的目的在于：提供一种即使在临床现场等也可简易且正确地进行检查的可进行基因分析的单链DNA产物的调制方法的技术。例如，在现有的条带技术中，使作为靶的DNA扩增，将已扩增的DNA产物在条带上“展开”，通过条带上的寡核苷酸与DNA产物发生杂交来进行判定。在该技术中，通过PCR大量扩增作为靶的DNA，在条带上展开其DNA产物。因此，为了在条带上进行DNA产物的检测，必须通过PCR进行扩增。但是，在通过PCR扩增的DNA产物中，往往会产生引物二聚体等非特异性DNA产物，在条带上检测到本来检测不到的DNA，存在着发生误判的问题。另外，在使用条带检测SNP(单核苷酸多态性)时采用以下方法：通过使PCR中使用的引物的3’末端与SNP所对应的碱基配合，扩增SNP所对应的双链DNA。但是，在SNP的PCR的扩增工序中，有时会错误地发生引物的杂交，出现精度进一步降低的问题。而且，在使用了条带的检测中，还考虑使用单链DNA序列进行检测的方法。例如考虑如下：在单链DNA的一个末端添加单一标签、在另一末端添加标记物质，通过PCR扩增的双链DNA产物通过热变性分离成单链DNA而获取。但是，在该方法中，在PCR中出现上述问题，不仅精度降低，而且DNA产物还因热变性而发生分离，因此将其在条带上展开时，已分离的单链DNA的一部分又返回到双链DNA中，出现灵敏度进一步降低的问题。因此，确立在临床现场等可以简易且高精度地进行检查的DNA检测技术是重要课题之一。特别是，谋求调制还能够用于使用了条带的基因检查技术的样品，所述基因检查技术不需要大的装置等，在临床现场等可以简易且高精度地进行检查。为了解决上述课题，本专利技术人着眼于：在用于检查的样品中不制作双链DNA产物，从而不扩增引物二聚体等非特异性双链DNA产物。因此，通过连接扩增，来研究开发极少引起误判定的单链DNA产物的调制方法。一直以来都存在获得单链DNA的技术。作为有名的技术，可以列举Digitag法(专利文献3、专利文献4)及LCR(专利文献5、专利文献6)这样的技术。但是，在这些技术中，可知用于反应的寡核苷酸非特异性地与核酸样品结合，而在条带上被误判为假阳性。对作为获得单链DNA的技术的Digitag法的工序进行说明。通过PCR扩增作为核酸样品的靶的基因序列。进行热变性，分离所得的PCR产物，之后使用Queryoligo(クエリーオリゴ)和Commonoligo(コモンオリゴ)进行连接反应，获得单链DNA的连接产物。以所得的单链DNA为模板，再次通过PCR进行扩增。所得的PCR产物通过热变性以单链形式分别注入微阵列上。微阵列上的寡核苷酸探针与单链DNA杂交，通过仪器读取由杂交的单链DNA发出的荧光并进行检测。此时，所得的单链DNA包括绿和红这两种荧光标记的引物。通过这些荧光形成绿和红、以及绿和红混合成的黄色。因此，在Digitag法中，在单色的绿或红的荧光检测中，即使另一个荧光标记的DNA发生杂交，但由于是微量，所以检测不到。因此，即使生成微量的二聚体也不会成为问题。但是，将通过上述的Digitag法所得的单链DNA在条带上展开时，即使是微少的基因量，也会以线条的形式进行反应，有时被检测为假阳性。因此，虽然Digitag法作为获得单链DNA的技术是优异的，但从精度方面考虑，无法在条带中使用。接下来，对作为获得单链DNA的技术的LCR反应的工序进行说明。通过PCR扩增作为核酸样品的靶的基因序列。PCR后，将Queryoligo和Commonoligo、以及与Queryoligo和Commonoligo互补的CQueryoligo和CCommonoligo、与连接酶等混合。将所得PCR产物进行热变性使之分离，之后使用Queryoligo和Commonoligo进行连接反应，获得单链DNA的连接产物。再利用与所得连接产物互补的CQueryoligo和CCommonoligo获得互补的连接产物。使用所得的连接产物和FQueryoligo和FCommonoligo获得连接产物。重复进行该工序，可以获得大量的单链DNA。但是，将通过上述LCR所得的单链DNA在条带上展开时，有时会被检测为假阳性。这是由于：为了生成大量的单链DNA，而在探针和模板之间发生错配杂交，以可作为假阳性的无意图的单链DNA的形式生成连接产物。另外，由于探针彼此发生错配杂交，而进一步生成无意图的单链DNA。因此，虽然LCR作为获得单链DNA的技术是优异的，但从精度方面考虑，无法在条带中使用。而且，如Digitag法所示，在通过多重PCR扩增的基因的种类增加时，容易发生反应的基因优先被扩增，而不易反应的基因的扩增效率有时会变差，没有检测到本来应该检测的核酸样品，还有可能误判为假阴性。用于解决课题的手段为了解决这些问题，本专利技术人着眼于不同于PCR或LCR、且不使用互补链DNA的基因扩增处理，找到了可以更简易且高精度地获取单链DNA的方法，完成了本专利技术。以往，制作单链DNA被指出存在以下问题：DNA的扩增效率较PCR差、灵敏度低。但是，与该指出相反，在本技术中实现了获取还可用于简易的检查的单链DNA。在本专利技术的更具体的方案中，通过控制连接的温度和反应时间、本文档来自技高网...

【技术保护点】
单链DNA的调制方法，其为用于基因检查的、调制单链DNA的方法，其中，通过将Common oligo和Query oligo在靶核酸上杂交，进行连接反应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.30 JP 2015-0173981.单链DNA的调制方法，其为用于基因检查的、调制单链DNA的方法，其中，通过将Commonoligo和Queryoligo在靶核酸上杂交，进行连接反应。2.权利要求1所述的单链DNA的调制方法，其中，在上述反应中，重复2次～100次的杂交和连接的工序循环。3.权利要求2所述的单链DNA的调制方法，其中，在上述反应中，1个循环中的杂交为10秒～2分钟左右，连接为10秒～2分钟左右。4.权利要求1～3中任一项所述的单链DNA的调制方法，其中，将靶DNA区利用PCR进行扩增之后，在经PCR扩增的靶DNA产物上杂交，进行连接反应。5.权利要求1～4中任一项所述的单链DNA的调制方法，其中，上述Queryoligo具有以下的(a)、(b)：(a)由与上述靶核酸互补的寡核苷酸构成的第一单链寡核苷酸；和(b)位于上述第一单链寡核苷酸的5'末端侧的标签序列或标记部分。6.权利要求5所述的单...

【专利技术属性】
技术研发人员：山下裕树，
申请(专利权)人：仓敷纺绩株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP