一种靛玉红衍生物的制备方法及其产物和应用技术

本发明专利技术提供一种靛玉红衍生物的制备方法及其产物和应用，该方法通过特殊诱导子提高微生物对靛玉红的生物转化，同时得到多种、高产率的基于靛玉红的羟基、甲基和或磺酸化修饰的化合物。本发明专利技术方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤红素衍生物，且制备的靛玉红衍生物具有高效、低毒等特点，具有抑制肿瘤、抑制艾滋病和乙肝病毒、抑制心肌缺血再灌注和扩张性心肌病损伤的良好作用。

【技术实现步骤摘要】
一种靛玉红衍生物的制备方法及其产物和应用【
】本专利技术涉及一种靛玉红衍生物的制备方法及其产物和应用。【
技术介绍
】青黛是中国药典收载的中重要药物之一,是由爵床科植物马蓝(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek.)、寥科植物寥蓝(Polygonum tinctorium Ait)或十字花科植物蒋蓝(Isatis indigotica Fort)的叶或莖叶经加工制得的干燥粉末或团块,主产于福建、云南、江苏、安徽等地，尤以福建所产的品质最佳，称建青黛。而靛玉红(indirubin)属双H引哚生物碱类化合物，是青黛的主要的活性成分之一，最近的研究表明，靛玉红及其衍生物对乳腺癌、肝癌、胰腺癌和肺癌等实体瘤和血液系统肿瘤均具有抗癌活性，与此同时，在炎症、神经系统疾病、自身免疫性疾病、银屑病等诸多疾病的研究中都显示很好的药理作用，为此，靛玉红在抑制肿瘤、抗炎、抑制缺血再灌注损伤和神经系统疾病药物开发方面，显示了巨大的应用前景[2]。然而在另一方面，靛玉红水溶性和脂溶性较差，体内吸收困难，生物利用度低，一定程度上限制了它在临床上的应用。为此，国内外的学者对靛玉红的结构进行了修饰和优化，以期得到溶解性好、疗效佳的靛玉红类似物(公开文献如下:张娜，蒋勇军，邹建卫，等.⑶K4与靛玉红及其衍生物复合物结构的模建.化学学报，2005，63 (9): 809-813)。国内外学者成功运用化学法对靛玉红I位、3'位、5位、5’位、6位、6’位、苯环和母核进行修饰和优化后得到一些抗癌作用更显著的靛玉红类似物及衍生物。例如，5-磺酸靛玉红,5-磺酸钠-3' 厢基-靛玉红(公开专利如下:(kim yc, kim sw, kimts，et al.1ndirubin derivatives having anticancer property against humancancer cell me:PCTj WO Patent2005/070416A1，2005-08-05)、(kim yc, kim sw,kimts, et al.1ndirubin derivatives having anticancer property against humancancer cell line:US Patent2009/7572923B2, 2009-08-11.)、(Eisenbrand Gj HeinzHF，Doris M et al.Use of cell membrane penetrating of indigoid bisindolederivatives, US Patent2003/6664285B1, 2003-12-16.)、(Olaf P，Andreas, S，GerhardS，et al.sulfur containing indirubin derivatives, their production and use:USPatent20020107404Al，2002-08-08)、(Eisenbrand G and Guatav K.Use of indigoidbisindole derivatives for the manufacture of a medicament to inhibit cyclindependent kinase inhibitors:PCTj W099/62503Patent, 1999-12-09) ) 5-甲基親玉红，5-磺酸甲基靛玉红，5-磺酸甲基-3'肟基-靛玉红(EP 1079826 BliUS 20020107404 Al)，5-氟、氯、溴、碘-1-甲基靛玉红，1-甲基-3’-肟基-靛玉红；1-甲基-6-溴-靛玉红，1-甲基-6-溴-3’-肟基(US 20100331327 AliWO 2005/041954 Al)，6_ 羟基-5 甲基-靛玉红(EP 1476426 BI)，5’-羟基-5-硝基-3’-肟基-靛玉红，5’-氯-5-硝基-3’-肟基-靛玉红(US 20120295948 Al )，6-漠-親玉红；6，6’ - 二漠_親玉红；6-漠-3’ - B亏基_青定玉红;6，6’-二溴-3’-肟基-靛玉红，6-溴-3’-甲肟基-靛玉红(W0 2005/041954 Al)等，其中以3'位的取代肟基、5位取代磺酸基和磺酸甲基研究最多，例如5-磺酸钠-3'肟基-靛玉红，修饰后的产物提高了水溶性，抗肿瘤活性增强，具有显著地抑制周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDKs)和糖原合成酶激酶 3 (Pharmacological inhibitorsof glycogen synthase kinase-3, GSK-3 β )活性,有望成为理想的抑制肿瘤、阿尔兹海默病(Alzheimer, s disease, AD)的候选药物,虽然化学修饰为大规模制备靛玉红相关衍生物提供了广阔的前景，但是但化学合成法存在得率低、选择性差、副产品多、过程较繁杂等缺点，具有一定的局限性，无法得到更多的磺酸或者肟基取代的靛玉红衍生物。而在另一方面，梅乐和等(梅乐和.细胞色素P450 BM-3 D168R变体酶以及应用其制备靛玉红的方法[硕士学位论文].浙江大学，2008)利用定向进化技术，以(F87V/A74G/L188Q/E435T)为父本，通过定点饱和突变得到P450 BM-3 D168R变体酶，可催化吲哚合成多种靛玉红衍生物，部分产物靛玉红_5，5' - 二甲酸甲酯、靛玉红-5' -甲酸-5-甲酸甲酯和5，5'-二苄氧基-靛玉红对651(-3 0/0、CDKl/cyclinB、CDK5/p25等靶点蛋白表现出突出的抑制效应。其中GSK_3a/i3有明显的抑制效应，但是生物合成方法，仍旧存在生产产率低、技术成本高、副产物多，分离难度大等缺陷，因此，需要利用微生物仿生代谢生产发酵优化，提高靛玉红衍生物产物的产率，直接得到多种与体内代谢活性相同或者不同的靛玉红羟基化或者磺基化靛玉红衍生物(公开文献为:杨波.靛玉红体内外代谢研究[硕士学位论文].第三军医大学，2009)。【
技术实现思路
】本专利技术要解决的技术问题之一，在于提供一种靛玉红衍生物的制备方法，该方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备靛玉红衍生物。本专利技术是这样实现上述技术问题之一的:一种靛玉红衍生物的制备方法，包括以下步骤:步骤一:取靛玉红15~ 20mg，溶解于150~200mL乙酸乙酯，使靛玉红浓度为0.lmg/mL ;另取磷脂550~572mg，使靛玉红与磷脂摩尔比为1:10混合，60 °C搅拌反应2.0h，反应完毕，除去乙酸乙酯，残余物用适量正己烷溶解后，离心后取上清液，将上清液转移至真空干燥器中减压干燥，所得紫红色半固体产物即为靛玉红磷脂复合物；步骤二:取保存于4°C、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25°C恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至IO7~IO8个/mL，既得种子孢子液；步骤三:以100ml，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤二所得孢子液，在pH至6.0，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靛玉红衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：取靛玉红15～20mg，溶解于150～200mL乙酸乙酯，使靛玉红浓度为0.1mg/mL；另取磷脂550～572mg，使靛玉红与磷脂摩尔比为1:10混合，60℃搅拌反应2.0h，反应完毕，除去乙酸乙酯，残余物用适量正己烷溶解后，离心后取上清液，将上清液转移至真空干燥器中减压干燥，所得紫红色半固体产物即为靛玉红磷脂复合物；步骤二：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，既得种子孢子液；步骤三：以100ml，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤二所得孢子液，在pH至6.0，温度30℃?±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入步骤一所得的靛玉红磷脂复合物，然后继续培养5天，每天检测各种靛玉红衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3%时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；步骤四：将步骤三提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用与其重量比为1:3～1:10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液；步骤五：将经过步骤四处理所得的分离提取液，先用1mg：1～10mL的乙醇溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，再依次用以下6种洗脱液进行洗脱:体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚：二氯甲烷洗脱液，二氯甲烷洗脱液，体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，乙酸乙酯洗脱液，体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯：甲醇洗脱液，以及甲醇洗脱液；然后TLC控制 收集主馏分，使用旋转蒸发仪将各个馏分溶液蒸干后，用适量甲醇溶解，再用0.22μm的滤膜过滤后，即得各种靛玉红衍生物分离液；步骤六：将经过步骤五处理所得的各种靛玉红衍生物分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的靛玉红衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶，即得靛玉红衍生物。...

【技术特征摘要】
1.一种靛玉红衍生物的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一:取靛玉红15~20mg，溶解于150~200mL乙酸乙酯，使靛玉红浓度为0.1mg/mL ;另取磷脂550~572mg，使靛玉红与磷脂摩尔比为1:10混合，60°C搅拌反应2.0h，反应完毕，除去乙酸乙酯，残余物用适量正己烷溶解后，离心后取上清液，将上清液转移至真空干燥器中减压干燥，所得紫红色半固体产物即为靛玉红磷脂复合物； 步骤二:取保存于4°C、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支,置于25°C恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至IO7~IO8个/mL，既得种子孢子液； 步骤三:以100ml，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤二所得孢子液，在pH至6.0，温度30°〇±1°C，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1~4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按I~IOug的接种量加入步骤一所得的靛玉红磷脂复合物，然后继续培养5天，每天检测各种靛玉红衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5~3%时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min，离心IOmin去除沉淀既得到发酵提取液； 步骤四:将步骤三提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用与其重量比为1:3~1:10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液； 步骤五:将经过步骤四处理所得的分离提取液，先用Img:1~IOmL的乙醇溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品 中低极性油类物质洗脱干净，再依次用以下6种洗脱液进行洗脱:体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液，二氯甲烷洗脱液，体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5的二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液，乙酸乙酯洗脱液，体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液，以及甲醇洗脱液；然后TLC控制收集主馏分，使用旋转蒸发仪将各个馏分溶液蒸干后，用适量甲醇溶解，再用0.22 μ m的滤膜过滤后，即得各种靛玉红衍生物分离液； 步骤六:将经过步骤五处理所得的各种靛玉红衍生物分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的靛玉红衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶，即得靛玉红衍生物。2.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法，其特征在于:所述土豆培养基为:土豆200g/L,葡萄糖20g/L ;配置时将土豆去皮后将其切成小块,加水加热煮沸30min,过滤。取滤液定容至1L，加入葡萄糖20g，搅拌溶解后，121°C灭菌30min，即得； 所述斜面培养基为:取上述土豆培养基1L，加入琼脂粉各20g，加热溶解后分装于玻璃试管中，于121 °C下灭菌30min后取出，倾斜45度，静置、冷却既得。3.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法，其特征在于:所述转化菌种为下述微生物中任意一种: 短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana)包括:AS3.970;AS3.153;AS3.910 ；AS3.954, AS3.2016 ;AS3.2017 ;AS3.2018 ;AS3.3401;或者刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)包括:AS3.154;AS3.952;AS3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981 ;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011 ;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716;AS3.400;或者雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans.)包括:AS3.156;AS3.1207 ;AS3.1659 ;AS3.2028 ;AS3.2031 ;AS3.2032 ;AS3.2033 ;AS3.2041 ;AS3.2476 ;AS3.2477;AS3.2717;AS3.3402;AS3.2476;小克银汉霉 CFCC5029;或者 Cunninghamella echinulatavar.elegans(Lendner) Lunn et Shipton,teleomorph ATCC9245 ；ATCC8688a ；ATCC8983 ；或者 Cunninghamella echinulata(Thaxter)Thaxter var.echinulata, teleomorphATCCl1585a ；ATCC36190 ；ATCC11585b ；ATCC9244 ；或者 Cunninghamella echinulatavar.elegans(Lendner)Lunn et Shipton, teleomorph ATCCl1064 ；ATCC10028a ；或者Cunninghamella elegans ATCC36112 ；ATCC26269 ;ATCC10028b ;黑曲霉Aspergillus niger包括:AS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;、AS3.879;AS3.939;AS3.940;AS3.1858 ;AS3.2931 ;AS3.3882 ;AS3.3883 ;AS3.4303; AS3928; AS3.4304 ;AS3.4309 ;AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523;黄曲霉、刺囊毛霉、细孢毛霉、链格孢、微紫青霉和荨麻青霉。4.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法，其特征在于:所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成: A组:A1为水杨酸,A2为乙酰水杨酸,A3为磺基水杨酸,A4为苯甲酸,A5为水杨酸甲酯、A6为对氨基水杨酸、A7为3，5- 二硝基水杨酸酯、AS为3，5- 二硝基水杨酸、A9为硫代水杨酸、AlO为5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸醇/异莰醇酯、Al I为5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸、A12为水杨酸4-庚烯-2-基酯、A13为水杨酸辛酯、A14为水杨酸锌、A15为水杨酰胺、A16为水杨酸钠、A17为乙酰水杨酸钠、A18为5-磺基水杨酸、A19为5-磺基水杨酸钠、A20为苯甲酸钠、A21为水杨酸乙酯、A21为对氨基水杨酸钠、A22为水杨酸镁； B组:BI为茉莉酸甲酯，B2为β-环糊精，Β3为壳聚糖，Β4为茉莉酸，Β5为为羧甲基-β-环糊精，Β6为2，6-二甲基-β-环糊精，Β7为谷胱甘肽，Β8为2-羟乙基茉莉，Β9为磺丁基-β -环糊精，BlO为羟乙基-β -环糊精，Bll为甲壳素；Β12为小克银汉霉属AL4粗诱导子，Β13为α -环糊精，Β14为2_羟丙基-β -环糊精，Β15为甲基化-β -环糊精； C组:C1为卡马西平，C2为莫达非尼，C3为奈韦拉平，C4为利福平，C5为贯叶连翘，C6为异烟肼，C7为胰岛素，C8为奥美拉唑，C9为苯巴比妥，ClO为泼尼松，Cl I为泼尼松龙，C12为地塞米松，C13为倍他米松，C14为倍氯米松，C15为戊酸倍他米松，C16为醋酸地塞米松，C17为9-氟-16 α -甲基11 β，17- 二羟基_3_氧_1，4_雄二烯-17 β -羧酸。5.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法，其特征在于: TLC控制收集主馏分，用体积比为5:4:4的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯为展开剂； 所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为:色谱柱Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18柱，其中分析柱内径乘...

【专利技术属性】
技术研发人员：张景红，欧万倩，谢深霞，刘谦，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：