用于CRISPR的大规模并行组合遗传学制造技术

本文中描述了能够迅速产生包含CRISPR指导序列和支架序列的遗传元件的高阶组合以及用于迅速鉴定单细胞或合并群体内所编码遗传元件之组合的条形码的方法和组合物。本文中还描述了表观遗传基因的抑制剂的组合物和用于降低细胞增殖和/或治疗癌症的方法。

Large scale parallel combinatorial genetics for CRISPR

In this paper, we describe a method and composition for rapidly producing higher-order combinations of genetic elements including CRISPR guidance sequences and stent sequences, and for barcode identification of combinations of genetic elements encoded in single cells or merged populations. The composition of inhibitors of epigenetic genes and methods used to reduce cell proliferation and / or treatment of cancer are also described in this article.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于CRISPR的大规模并行组合遗传学相关申请本申请根据35U.S.C.119(e)要求2014年10月31日提交的美国临时申请号62/073,126和2015年5月26日提交的美国临时申请号62/166,302的权益，其各自通过引用整体并入本文。政府资助本专利技术是在由国立卫生研究院授予的基金号OD008435的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
本专利技术涉及用于迅速产生包含CRISPR指导序列和支架序列的遗传元件的高阶组合的方法和组合物，以及所述遗传元件的鉴定。本专利技术还涉及靶向表观遗传基因以抑制细胞增殖的抑制剂的组合物和相关方法。
技术介绍
成簇规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)/Cas系统最初在细菌和古细菌物种中作为抵抗外来遗传物质(例如质粒和噬菌体)的防御机制被发现。天然存在的CRISPR/Cas系统依赖于三种组分的表达：与靶序列互补的指导RNA序列、有助于将第三种组分(即，内切核酸酶)募集到位点的支架RNA。尽管在许多细菌和古细菌物种中，CRI本文档来自技高网...

【技术保护点】
遗传构建体，其包含第一DNA元件，所述第一DNA元件包含CRISPR指导序列和支架序列；所述第一DNA元件侧翼的第一相容性末端元件和第二相容性末端元件，其中所述第一和第二相容性末端元件能够与彼此退火；条形码元件；所述条形码元件侧翼的第三相容性末端元件和第四相容性末端元件，其中所述第三和第四相容性末端元件能够与彼此退火但不能与所述第一或第二相容性末端元件退火；以及位于所述第四相容性末端元件和所述第一相容性末端元件之间的隔离位点，其中所述DNA元件、第一相容性末端元件和第二相容性末端元件位于隔离位点的一侧，且所述条形码元件、第三相容性末端元件和第四相容性末端元件位于隔离位点的另一侧.

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.31 US 62/073,126;2015.05.26 US 62/166,3021.遗传构建体，其包含第一DNA元件，所述第一DNA元件包含CRISPR指导序列和支架序列；所述第一DNA元件侧翼的第一相容性末端元件和第二相容性末端元件，其中所述第一和第二相容性末端元件能够与彼此退火；条形码元件；所述条形码元件侧翼的第三相容性末端元件和第四相容性末端元件，其中所述第三和第四相容性末端元件能够与彼此退火但不能与所述第一或第二相容性末端元件退火；以及位于所述第四相容性末端元件和所述第一相容性末端元件之间的隔离位点，其中所述DNA元件、第一相容性末端元件和第二相容性末端元件位于隔离位点的一侧，且所述条形码元件、第三相容性末端元件和第四相容性末端元件位于隔离位点的另一侧.2.权利要求1所述的遗传构建体，其还包含所述第一DNA元件上游的启动子元件.3.载体，其包含根据权利要求1或2所述的遗传构建体.4.遗传构建体，其包含：多个DNA元件，其中所述多个DNA元件中的每个DNA元件包含CRISPR指导序列和支架序列；所述多个DNA元件侧翼的第一相容性末端元件和第二相容性末端元件，其中所述第一和第二相容性末端元件能够与彼此退火；多个条形码元件；所述多个条形码元件侧翼的第三相容性末端元件和第四相容性末端元件，其中所述第三和第四相容性末端元件能够与彼此退火但不能与所述第一或第二相容性末端元件退火；以及位于所述多个DNA元件与所述多个条形码元件之间的隔离位点。5.载体，其包含根据权利要求4所述的遗传构建体和位于每个所述CRISPR指导序列上游的启动子序列.6.用于产生组合载体的方法，其包括：(a)提供含有第一遗传构建体的载体，所述第一遗传构建体包含：CRISPR指导序列；所述CRISPR指导序列侧翼的第二相容性末端元件和第一限制性酶的第一识别位点；条形码元件；和所述条形码元件侧翼的第三相容性末端元件和第二限制性酶的第二识别位点；(b)在所述第一识别位点处切割所述第一遗传构建体，得到第五相容性末端元件，并且在所述第二识别位点处切割所述载体，得到第六相容性末端元件；(c)提供支架元件，所述支架元件包含支架序列；包含第一相容性末端元件和第四相容性末端元件的隔离位点；和所述支架元件侧翼的第七相容性末端元件和第八相容性末端元件，其中所述第七相容性末端元件能够与所述第五相容性末端元件退火，并且所述第八相容性末端元件能够与所述第六相容性末端元件退火；(d)使所述支架元件与经切割的第一遗传构建体退火，其中所述退火发生在所述载体和所述支架元件内能够与彼此退火的相容性末端元件处，并且其中在退火后，所述支架元件整合在所述CRISPR指导序列与所述条形码元件之间，并且其中所述隔离位点位于所述支架序列与所述条形码元件之间，从而产生组合载体.7.权利要求6所述的方法，其还包括：(a)提供根据权利要求C1的组合载体；(b)在所述支架元件内的隔离位点处切割所述载体，得到第一相容性末端元件和第四相容性末端元件；(c)提供第二遗传构建体，所述第二遗传构建体包含CRISPR指导序列；支架序列；条形码元件；和所述第二遗传构建体侧翼的第二相容性末端元件和第三相容性末端元件，其中所述第二遗传构建体的第二相容性末端元件能够与所述载体的第一相容性末端元件退火，并且所述第二遗传构建体的第三相容性末端元件能够与所述载体的第四相容性末端元件退火；(d)使所述第二遗传构建体与经切割的载体退火，其中所述退火发生在所述第二遗传构建体和所述载体内能够与彼此退火的相容性末端元件处，并且其中在退火后，所述第二遗传构建体整合在所述载体中，产生包含串联的条形码元件和串联的CRISPR指导序列以及支架序列的组合载体.8.权利要求7所述的方法，其中所述组合载体还包含所述CRISPR指导序列上游的启动子元件.9.权利要求7或8所述的方法，其中所述方法是迭代的.10.权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述第一识别位点和所述第二识别位点具有相同的识别位点序列，并且所述第一限制性酶和所述第二限制性酶是相同的限制性酶.11.遗传构建体，其包含至少两个CRISPR指导序列；条形码元件；和位于每个CRISPR指导序列之间和位于所述条形码元件与最接近所述条形码元件的CRISPR指导序列之间的限制性识别位点.12.遗传构建体，其包含多个DNA元件，每个DNA元件包含CRISPR指导序列和支架序列；条形码元件；和位于所述多个DNA元件中的每个DNA元件上游的启动子序列.13.权利要求11或12所述的遗传构建体，其中所述条形码元件位于所述遗传构建体的5’末端.14.权利要求11或12所述的遗传构建体，其中所述条形码元件位于所述遗传构建体的3’末端.15.载体，其包含根据权利要求11至14所述的任何遗传构建体.16.用于产生组合载体的方法，其包括：(a)提供载体，所述载体包含：多个CRISPR指导序列；条形码元件，其中所述条形码元件位于所述多个CRISPR指导序列的下游；任选的启动子序列，其位于所述多个CRISPR指导序列中的至少一个之上游；和多种限制性酶的多个识别位点，其中所述多个识别位点各自位于所述多个CRISPR指导序列之一的下游；(b)用所述多种限制性酶中的至少一种在所述多个识别位点的至少一个处切割所述载体，得到第一相容性末端元件和第二相容性末端元件；(c)提供第一支架元件，所述第一支架元件包含：支架序列，任选的启动子序列，和所述第一支架元件侧翼的第三相容性末端元件和第四相容性末端元件，其中所述第三相容性末端元件能够与经切割的载体的第一相容性末端元件退火，并且所述第四相容性末端元件能够与经切割的载体的第二相容性末端元件退火；(d)使所述第一支架元件与经切割的载体退火，其中所述退火发生在所述第一支架元件和经切割的载体内的相容性末端元件处，并且其中在退火后，所述第一支架元件整合在所述多个CRISPR指导序列之一的下游，从而产生组合载体.17.权利要求16所述的方法，其中所述方法是迭代的.18.用于产生组合载体的方法，其包括：(a)提供载体，所述载体包含：多个CRISPR指导序列，条形码元件，其中所述条形码元件位于所述多个CRISPR指导序列的上游；任选的启动子序列，其位于所述多个CRISPR指导序列的至少一个之上游；和多种限制性酶的多个识别位点，其中所述多个识别位点各自位于所述多个CRISPR指导序列之一的上游；(b)用所述多种限制性酶中的至少一种在所述多个识别位点的至少一个处切割所述载体，得到第一相容性末端元件和第二相容性末端元件；(c)提供第一支架元件，所述第一支架元件包含：任选的支架序列，启动子序列，和所述第一支架元件侧翼的第三相容性末端元件和第四相容性末端元件，其中所述第三相容性末端元件能够与经切割的载体的第一相容性末端元件退火，并且所述第四相容性末端元件能够与经切割的载体的第二相容性末端元件退火；(d)使所述第一支架元件与经切割的载体退火，其中所述退火发生在所述第一支架元件和经切割的载体内的相容性末端元件处，并且其中在退火后，所述第一支架元件整合在所述多个CRISPR指导序列之一的上游，从而产...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢冠达，黄兆麟，蔡正姿，
申请(专利权)人：麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：美国,US