通过电穿孔将Cas9 mRNA导入到哺乳动物的受精卵的方法技术

本发明专利技术涉及一种向哺乳动物的受精卵导入编码Cas9蛋白的mRNA(Cas9 mRNA)的方法，包括如下的各阶段：(a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；(b)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加电压，最低mRNA导入效率(Rmin)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过电穿孔将Cas9mRNA导入到哺乳动物的受精卵的方法
本专利申请基于日本专利申请第2015-031006号而主张优先权，通过在此进行参照而将其整体并入本说明书中。本专利技术涉及一种通过电穿孔将编码Cas9蛋白的mRNA(Cas9mRNA)导入到哺乳动物的受精卵的方法。本专利技术还涉及利用上述方法制造表达Cas9的哺乳动物的受精卵；利用哺乳动物的受精卵进行基因组编辑；制作经基因组编辑的哺乳动物的受精卵；或制作基因修饰动物。
技术介绍
目前，在包括医学和生物学的各种研究领域中，为了阐明生物的基本机制或者作为人的疾病模型而使用基因修饰动物。作为迅速的基因修饰动物的制作方法，ZFN(锌指核酸酶(Zinc-FingerNucleases))、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶(TranscriptionActivator-LikeEffectorNucleases))和CRISPR/Cas系统(成簇的规律间隔的短回文重复序列系统(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat-AssociatedSystem))等利用人工限制酶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种向哺乳动物的受精卵导入编码Cas9蛋白的mRNA、即Cas9 mRNA的方法，包括以下各阶段：(a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；(b)以实现最低mRNA导入效率Rmin以上的mRNA导入效率R的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率Rmin通过下式(A)由Cas9 mRNA浓度c算出，所述浓度c的单位是ng/μl，式(A)Rmin＝882/c其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率R是通过式(I)R＝0.0005×t

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.19 JP 2015-0310061.一种向哺乳动物的受精卵导入编码Cas9蛋白的mRNA、即Cas9mRNA的方法，包括以下各阶段：(a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9mRNA的溶液与受精卵的混合物；(b)以实现最低mRNA导入效率Rmin以上的mRNA导入效率R的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率Rmin通过下式(A)由Cas9mRNA浓度c算出，所述浓度c的单位是ng/μl，式(A)Rmin＝882/c其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率R是通过式(I)R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t算出的值，每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率R是通过式(II)R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t由通电时间t算出的值，每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率R是通过式(III)R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t由通电时间t算出的值，每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率R是通过式(IV)R＝0.0078×t3-0.1414×t2+3.0103×t由通电时间t算出的值，所述通电时间t的单位是msec，其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，电压与通电时间的积为每1mm电极间距离约990Vmsec以下。2.根据权利要求1所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约25V～约35V。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约30V。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，Cas9mRNA浓度为约50ng/μl以上，每1mm电极间距离的电压为约20V以上，通电时间为约36msec以上。5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，Cas9mRNA浓度为约50ng/μl以上，每1mm电极间距离的电压为约30V以上，通电时间为约21msec以上。6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，Cas9mRNA浓度为约200ng/μl以上，每1mm电极间距离的电压为约20V以上，通电时间为约15msec以上。7.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，Cas9mRNA浓度为约200ng/μl以上，每1mm电极间距离的电压为约30V以上，通电时间为约5msec以上。8.一种向哺乳动物的受精卵导入Cas9mRNA的方法，包括以下各阶段：(a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9mRNA的溶液与受精卵的混合物；(c)以实现最低mRNA导入效率Rmin以上的mRNA导入效率R的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率Rmin通过下式(B)由Cas9mRNA浓度c算出，所述浓度c的单位是ng/μl，式(B)Rmin＝441/c其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率R是通过式(I)R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t算出的值，每1m...

【专利技术属性】
技术研发人员：桥本昌和，竹本龙也，
申请(专利权)人：国立大学法人德岛大学，桥本昌和，株式会社贝库斯，
类型：发明
国别省市：日本,JP