免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体制造技术

本发明专利技术提供保持高的免疫球蛋白结合能力和耐碱性的亲和色谱用载体。一种免疫球蛋白结合蛋白质，包含至少1个改性免疫球蛋白结合结构域，该改性免疫球蛋白结合结构域是由如下的氨基酸序列构成的多肽，该氨基酸序列是针对金黄色葡萄球菌蛋白A的选自B结构域、Z结构域、C结构域以及它们的变异体中的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，在相当于该B结构域、Z结构域或者C结构域的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基。

Immunoglobulin binding protein and its affinity carrier

The present invention provides an affinity chromatography carrier for maintaining high immunoglobulin binding capacity and alkali resistance. An immunoglobulin binding protein, containing at least 1 modified immunoglobulin binding domain binding domain of the modified immunoglobulin polypeptide is composed of the following amino acid sequence, the amino acid sequence for immunoglobulin from B domain, staphylococcal protein A, Z domain the C domain and their variants in the binding domain in amino acid sequence, amino acid sequence between the equivalent of the B domain, Z domain and C domain of the 3 and 4 positions into at least 1 amino acid residues.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体
本专利技术涉及免疫球蛋白结合蛋白质、使用其的亲和载体、以及使用该亲和载体的免疫球蛋白的分离方法和抗体医药品的制造方法。
技术介绍
亲和色谱是使用填充有配体固定化载体的色谱柱的色谱法，所述配体固定化载体是将与以分离或者纯化为目的的物质特异性结合的物质(配体)固定于不溶性载体而得到的。亲和色谱用于例如蛋白质、核酸等生物体相关物质的分离·纯化(专利文献1)。作为亲和色谱用载体，例如一直使用琼脂糖凝胶所代表的糖链的交联粒子、以合成聚合物为主成分的粒子。在亲和色谱用载体的制作中，需要将与目标物质特异性结合的物质即配体固定于载体。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A(SpA)及其变异体作为具有与免疫球蛋白特异性结合能力的代表性的亲和色谱配体而为人所知。SpA因为在不对免疫球蛋白对抗原的高选择性给予显著影响的情况下具有与免疫球蛋白的Fc区域结合的能力，所以能够高效地捕捉和纯化免疫球蛋白和含有Fc区域的蛋白质。天然型的SpA中作为与免疫球蛋白具有结合能力的结构域，从N末端依次包含E、D、A、B以及C这5个结构域。这些结构域和属于B结构域的改性型结构域的Z结构域一直作为亲和色谱配体使用。另外，出于提高免疫球蛋白结合能力的目的，一般使用将2个以上的上述结构域连接而成的物质作为配体。上述SpA的免疫球蛋白结合结构域中分别包含3个α－螺旋结构，已知它们中N末端侧的2个α－螺旋部位有助于与免疫球蛋白的结合。并且，报告了上述结构域中B和C结构域中，由N末端3位的Asn和4位的Lys形成转角结构(非专利文献1)。因此，在B结构域、C结构域或者属于B结构域的改性型结构域的Z结构域多个连接而得的配体中，推测起因于上述的转角结构，各结构域被相互弯曲的配置而连接，会发生该弯曲的配置所致的立体障碍。该立体障碍在制作以B结构域、C结构域或者Z结构域的重复结构为配体的亲和色谱用载体方面是深刻的问题。即，由于上述立体障碍，配体的免疫球蛋白结合能力较低，作为结果为了纯化一定量的免疫球蛋白而需要大量的载体量。以SpA为配体的亲和色谱用载体大多情况下非常昂贵，需要大量的载体量从制造成本的观点考虑不优选。亲和色谱用载体在生物分离的用途中通常被重复使用。因此通常在重复使用期间进行作为原位清洗(CIP)而被人熟知的用于除去夹杂物使载体返回原本状态的清洗工序。作为用于CIP的试剂，例如使用氢氧化钠等碱性溶液。然而，对于使用蛋白质作为配体的亲和色谱用载体而言，这样的碱性条件是苛刻的，有时随着配体的失活或切断，失去对靶分子的结合能力。对于上述碱性条件下的配体的失活，Asn和Gln残基的脱酰胺化作为其主要因素而广为人知。特别是报告了Asn对碱性条件的感受性高，并且其脱酰胺化是结构依赖性的，时常发生在Asn－Gly或者Asn－Ser表示的氨基酸序列部位(非专利文献2)。作为用于避免上述碱性条件下的配体失活的现有技术，可举出利用Asn残基的缺失、改性而得到对碱的感受性降低的配体。通过使用上述配体，提供即便实施多次使用了碱性溶液的CIP后，也能够维持其免疫球蛋白结合能力的亲和色谱载体。例如，专利文献2中提供一种包含SpA的B结构域、C结构域或者Z结构域的亲和色谱用载体的配体，该配体包含从至少1个结构域的1位或者2位开始的N末端侧的至少3个连续的氨基酸的缺失。另外，专利文献3提供了一种包含从N末端侧3位到6位的连续的氨基酸发生缺失的SpA的C结构域的亲和色谱载体用的配体。另外，专利文献4中提供了一种SpA的Z结构域、B结构域中的Asn残基经修饰的亲和色谱载体用的配体。但是，上述的现有技术以提高载体的耐碱性为主要目的，并未提及提高载体的免疫球蛋白结合能力。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开平6－281638号公报专利文献2:日本特开2012－254981号公报专利文献3:日本专利第5345539号公报专利文献4:日本特表2002－527107号公报非专利文献非专利文献1:Structure，2014，22：1467－1477非专利文献2:JournalofBiotechnology，2000，80：169－178
技术实现思路
寻求一种保持高的免疫球蛋白结合能力和耐碱性的、高效且经济价值高的亲和载体。本专利技术的一个形式是提供提高对免疫球蛋白的结合能力的、新的亲和载体用配体。另外，本专利技术的另一个形式是提供在反复实施使用了碱性溶液的CIP的情况下也能够维持上述高的免疫球蛋白结合能力的亲和载体。因此在一个方式中，本专利技术提供免疫球蛋白结合蛋白质。该免疫球蛋白结合蛋白质包含至少1个改性免疫球蛋白结合结构域，该改性免疫球蛋白结合结构域是由如下氨基酸序列构成的多肽，该氨基酸序列是针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A(SpA)的选自B结构域、Z结构域、C结构域以及它们的变异体中的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，在相当于该B结构域、Z结构域或者C结构域的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基而成的。本专利技术的免疫球蛋白结合蛋白质的一个实施方式中，选自上述B结构域、Z结构域、C结构域以及它们的变异体中的免疫球蛋白结合结构域是由序列号1～3中的任一个表示的氨基酸序列或者与它们具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域。本专利技术的免疫球蛋白结合蛋白质的一个实施方式中，上述至少1个改性免疫球蛋白结合结构域从以下多肽中选择：针对由序列号1表示的氨基酸序列或者与其具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域，在相当于序列号1表示的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的多肽；针对由序列号2表示的氨基酸序列或者与其具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域，在相当于序列号2表示的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的多肽；以及针对由序列号3表示的氨基酸序列或者与其具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域，在相当于序列号3表示的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的多肽。本专利技术的免疫球蛋白结合蛋白质的一个实施方式中，上述至少1个氨基酸残基为选自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp和Tyr中的至少1个。本专利技术的免疫球蛋白结合蛋白质的一个实施方式中，由与上述序列号1～3中的任一个表示的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域为Val1/Ala29变异体。一个实施方式中，本专利技术的免疫球蛋白结合蛋白质包含2～12个的上述改性免疫球蛋白结合结构域。另一方式中，本专利技术提供编码上述变异免疫球蛋白结合蛋白质的多核苷酸。又一方式中，本专利技术提供包含上述多核苷酸的载体。又一方式中，本专利技术提供包含上述载体的重组体。又一方式中，本专利技术提供一种免疫球蛋白结合蛋白质的制造方法，包括：利用无细胞蛋白质合成系统表达上述多核苷酸、或者在上述重组体中表达上述多核苷酸。进而在另一方式中，本专利技术提供免疫球蛋白结合蛋白质的制造方法。该方法是包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫球蛋白结合蛋白质，包含至少1个改性免疫球蛋白结合结构域，该改性免疫球蛋白结合结构域是由如下的氨基酸序列构成的多肽，所述氨基酸序列是针对金黄色葡萄球菌蛋白A的选自B结构域、Z结构域、C结构域以及它们的变异体中的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，在相当于该B结构域、Z结构域或C结构域的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基而成的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.26 JP 2015-0635191.一种免疫球蛋白结合蛋白质，包含至少1个改性免疫球蛋白结合结构域，该改性免疫球蛋白结合结构域是由如下的氨基酸序列构成的多肽，所述氨基酸序列是针对金黄色葡萄球菌蛋白A的选自B结构域、Z结构域、C结构域以及它们的变异体中的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，在相当于该B结构域、Z结构域或C结构域的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基而成的。2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，所述选自B结构域、Z结构域、C结构域以及它们的变异体中的免疫球蛋白结合结构域是由序列号1～3中任一个表示的氨基酸序列或者与它们具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域。3.根据权利要求1或2所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，所述至少1个改性免疫球蛋白结合结构域从以下多肽中选择：针对由序列号1表示的氨基酸序列或者与其具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域，在相当于序列号1表示的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的多肽；针对由序列号2表示的氨基酸序列或者与其具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域，在相当于序列号2表示的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的多肽；以及针对由序列号3表示的氨基酸序列或者与其具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域，在相当于序列号3表示的氨基酸序列的3位与4位的位置之间插入了至少1个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的多肽。4.根据权利要求1～3中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，所述至少1个氨基酸残基是选自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp和Tyr中的至少1个。5.根据权利要求2～4中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，由与所述序列号1～3中任一个表示的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域是Val1/Ala29变异体。6.根据权利要求1～5中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，包含2～12个的所述改性免疫球蛋白结合结构域。7.一种多核苷酸，编码权利要求1～6中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质。8.一种载体，包含权利要求7所述的多核苷酸。9.一种重组体，包含权利要求8所述的载体。10.一种免疫球蛋白结合蛋白质的制造方法，包括：利用无细胞蛋白质合成系统表达权利要求7所...

【专利技术属性】
技术研发人员：安冈润一，市居敬，中村聪，塩谷知范，板谷佳织，
申请(专利权)人：JSR株式会社，JSR生命科学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP