改良型β‑呋喃果糖苷酶制造技术

本发明专利技术提供能够抑制蔗果四糖的生成、高效生成蔗果三糖的改良型β‑呋喃果糖苷酶。一种改良型β‑呋喃果糖苷酶，其含有下述(a)或(b)的氨基酸序列：(a)对于序列号2所示的氨基酸序列导入了以下的i)和/或ii)的氨基酸变异的氨基酸序列，i)将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异，ii)将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异；(b)含有在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列且具有β‑呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。

The modified beta fructofuranosidase

The present invention provides improved beta fructofuranosidase can generate four sugar cane fruit and inhibit the efficient generation of three sugar cane fruit. An improved beta fructofuranosidase, contains (a) or (b) amino acid sequence: (a) for amino acid sequence import sequence number 2 as shown in the following I) and / or II) amino acid sequence of amino acid variation, I) will end up eighty-fifth bit N glycine (G) replacement of glycine (G) amino acid mutations outside the protein amino acid composition, II) N terminal 310th histidine (H) replacement for lysine (K), arginine (R) or tyrosine (Y) amino acid mutation; (b) containing in (a) in the deletion and substitution, insertion or addition of additional amino acid sequence of one or more amino acids than amino acid amino acid mutation into the amino acid sequence and has beta fructofuranosidase activity.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改良型β-呋喃果糖苷酶
本专利技术涉及改良型β-呋喃果糖苷酶，尤其涉及能够抑制蔗果四糖的生成、有效生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶、含有其氨基酸序列的多肽、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA、含有该DNA的重组载体、将该DNA或该重组载体导入宿主而获得的转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法和使用了它们的蔗果三糖的制造方法。
技术介绍
β-呋喃果糖苷酶是对在末端含有果糖残基的糖质的果糖进行识别、水解的酶。β-呋喃果糖苷酶中还存在如下β-呋喃果糖苷酶：除了水解活性以外，还具有将因水解而产生的果糖转移至基质的果糖转移活性。根据这样的β-呋喃果糖苷酶，能够以蔗糖为基质，生成1分子葡萄糖和2分子果糖结合而成的三糖、即蔗果三糖。已知的是，蔗果三糖中的1-蔗果三糖是与蔗糖(砂糖)相似的甜味物质，产生砂糖的三分之一程度的甜度但能量仅为砂糖大约一半、即使摄取也不会使血糖值上升、发挥过敏抑制功能(专利文献1)等，因此是有用的寡糖。作为生成1-蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶，例如公开了在来自黑曲霉(Aspergillusniger)的β-呋喃果糖苷酶及其氨基酸序列中导入了氨基酸变异的变异体β-呋喃果糖苷酶(专利文献2和专利文献3)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第4162147号公报专利文献2：日本专利第3628336号公报专利文献3：国际公开第2005/085447号
技术实现思路
专利技术要解决的课题当以蔗糖基质、使用β-呋喃果糖苷酶制造蔗果三糖时，通常作为副产物而生成作为四糖的蔗果四糖。如后述的实施例1(1)所示，在糖液中以一定的比例以上存在的蔗果四糖妨碍晶析工序中蔗果三糖的结晶化。此外，如后述的实施例1(2)所示，蔗果四糖在色谱中难以与蔗果三糖分离，即使利用色谱进行分离纯化工序也难以使其含有比例降低。由于这些原因，为了高效地制造蔗果三糖晶体，需要在利用β-呋喃果糖苷酶的酶反应的反应液中提高蔗果三糖的生成量以及蔗果三糖的含有比例、并且充分降低蔗果四糖的含有比例。因此，需要一种能够抑制蔗果四糖的生成并且高效地生成蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶。本专利技术是为了解决这样的技术问题而作出的，目的在于，提供能够抑制蔗果四糖的生成并且有效生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶、含有其氨基酸序列的多肽、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA、含有该DNA的重组载体、将该DNA或该重组载体导入宿主而获得的转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法和蔗果三糖的制造方法。用于解决课题的手段本专利技术人等进行了深入研究，结果发现，通过对于来自Aspergilluskawachii(川地黑曲霉)NBRC4308(以下简写为“A.kawachii”。)的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2；全长628氨基酸)，导入将氨基末端(N末端)起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异、或将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异，能够抑制蔗果四糖的生成并且高效地生成蔗果三糖，基于这些见解，完成了下述的各专利技术。(1)本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：(a)对于序列号2所示的氨基酸序列(全长628个氨基酸)导入了以下的i)和/或ii)的氨基酸变异的氨基酸序列；i)将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异，ii)将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异；(b)由在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。(2)本专利技术的多肽含有(1)记载的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列。(3)本专利技术的DNA编码(1)记载的改良型β-呋喃果糖苷酶。(4)本专利技术的重组载体含有(3)记载的DNA。(5)本专利技术的转化体是将(3)记载的DNA或(4)记载的重组载体导入宿主而获得的转化体。(6)本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法具有：从培养(5)记载的转化体而获得的培养物取得改良型β-呋喃果糖苷酶的工序。(7)本专利技术的蔗果三糖的制造方法具有：使(1)记载的改良型β-呋喃果糖苷酶、(5)记载的转化体或培养(5)记载的转化体而获得的培养物与蔗糖接触的工序。专利技术效果根据本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶、本专利技术的转化体、本专利技术的蔗果三糖的制造方法，能够抑制蔗果四糖的生成、高效地制造蔗果三糖。此外，根据本专利技术的多肽、本专利技术的DNA、本专利技术的重组载体、本专利技术的转化体、本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法，能够获得可抑制蔗果四糖的生成比例、高效地生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶。具体实施方式以下，对本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体、转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法和蔗果三糖的制造方法进行详细说明。本专利技术中，“β-呋喃果糖苷酶”有时与“果糖基转移酶”、“蔗糖酶”、“β-D-呋喃果糖苷酶”、“转化酶”、“invertase”或“invertin”互换使用。此外，本专利技术中的“野生型β-呋喃果糖苷酶”是指含有未使用基因工程方法导入氨基酸变异的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶，“改良型β-呋喃果糖苷酶”是指含有对野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入了1个或2个以上的氨基酸变异的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶。本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶由下述(a)或(b)的氨基酸序列：(a)对于序列号2所示的氨基酸序列(全长628个氨基酸)导入了以下的i)和/或ii)的氨基酸变异的氨基酸序列，i)将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异，ii)将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异；(b)由在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。在此，“蛋白组成氨基酸”是指下述的表1揭示的物质(生化学事典第4版；东京化学同人公司发行，第57页，2007年12月)。它们之中，作为本专利技术的“甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸”，优选可列举芳香族氨基酸、杂环式氨基酸、酸性氨基酸和碱基性氨基酸，更优选可列举色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、天冬氨酸(D)谷氨酸(E)和精氨酸(R)。[表1]蛋白组成氨基酸的种类和简称※1：组氨酸属于碱性氨基酸。酸性、碱性以外的氨基酸为中性氨基酸。※2：有时也指包括杂环式氨基酸在内的芳香族氨基酸。※3：Asx意思是Asp或Asn，用单字母表示则为B。※4：Glx意思是Glu或Gln，用单字母表示则为Z。上述(b)是与(a)的序列同源性高、具有与在(a)中导入的氨基酸变异相当的氨基酸变异、并且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。在此，作为(a)与(b)的同源性的值，例如可列举80～85％以上、85～90％以上、90～95％以上等。即，(b)由例如“在与(a)的同源性的值不小于80～90％的范围内、在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良型β‑呋喃果糖苷酶，其由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：(a)对于序列号2所示的氨基酸序列导入了以下的i)和/或ii)的氨基酸变异的氨基酸序列，i)将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异，ii)将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异；(b)由在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有β‑呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.11 JP 2015-0487891.一种改良型β-呋喃果糖苷酶，其由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：(a)对于序列号2所示的氨基酸序列导入了以下的i)和/或ii)的氨基酸变异的氨基酸序列，i)将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异，ii)将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异；(b)由在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：栃尾巧，伊藤有未，中村早岐，深谷喜美，藤井匡，田村圭辅，
申请(专利权)人：物产食品科技股份有限公司，日本迈科洛生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：日本,JP