GM杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种杂交瘤细胞，其保藏编号为CGMCC No.13827。该杂交瘤细胞能够生产抗曲霉菌半乳甘露聚糖抗原之单克隆抗体，并由此制备试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒能够与GM抗原特异性结合，其敏感性和特异性均在95％以上，检测限从现有产品的1ng/mL降低到了0.85ng/mL，结果与参比试剂符合率高，能提供更准确可靠的检验结果，使得能够在病程早期即可检测出IA，使患者能够及时有效的得到治疗，提高患者的生存率。且该试剂盒操作简便易行，检测快速灵敏，所用酶标仪简单、普及，价格低廉，该检测试剂盒为GM抗原定量检测提供了一种有效工具。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】GM杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂盒及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种生产抗曲霉菌半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM)抗原之单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂盒以及其制备方法与应用。
技术介绍
曲霉菌(Aspergillus)是广泛存在于自然界的一种腐生菌及正常人体皮肤黏膜的常驻真菌。曲霉孢子较小，直径2-3μm，可以在空气中漂浮，并且通过呼吸道进入人体。由于曲霉主要通过呼吸道进入人体，所以曲霉感染主要发生在肺部。在免疫抑制患者中侵袭性曲霉病(InvasiveAspergillosis，IA)的发病率由于抗生素的滥用而逐年增高，并成为其死亡的主要原因，烟曲霉菌是引起免疫抑制患者严重深部曲霉菌感染的最常见病原菌，其次还有黄曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌等。IA在血液病和造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplants，HSCT)患者中死亡率高达70％-90％，造成这种高死亡率的主要原因在于不能在病程早期对IA进行有效检测诊断，以至患者得不到及时有效的治疗而死亡，因此选择早期检测诊断方法具有重要的意义。目前得到广泛认可的曲霉菌抗原检测方法主要有1,3-β-D葡聚糖检测(G试验)和半乳甘露聚糖检测(GM试验)。1,3-β-D葡聚糖抗原是除结合菌和隐球菌外所有真菌的一种特异性细胞壁成分，以血清为检测样本，其灵敏度和特异性可达到80％。但由于对定植的念珠菌显示阴性，常需要和GM试验联合检测进行排除，两者皆阴性才基本可排除真菌感染。另外，血清学G试验容易受到血液学及其他因素如纤维类物质等的影响，且1,3-β-D葡聚糖抗原在血液中可与抗体形成免疫复合物，迅速被血液清除，造成假阴性。半乳甘露聚糖是存在于曲霉菌细胞壁中的一类具有高度特异性和高度保守型的多糖，可作为曲霉菌检测的特异性分子标志物，酶联免疫吸附试验(ELISA)是较为常见的半乳甘露聚糖检测方法，AcostaJ报道GM阳性结果较曲霉菌培养早4.3天。血清GM试验阳性对侵袭性真菌感染的拟诊是恰当和适用的，且对于采取早期的抗真菌治疗的患者，尤其对一些高风险患者(如HSCT患者)更是重要的提示。因此测定血清中的GM抗原水平有助于IA的早期诊断、早期治疗。目前市面上曲霉菌GM检测试剂盒检测的敏感性、特异性、灵敏性均较低，敏感性约为83％，特异性为90％，检测限约为1μg/L。且一般采用双抗夹心法，即先将曲霉菌的特异单克隆抗体包被在酶标板上，再加入待检样本和辣根过氧化物酶(HRP)标记的同一单克隆抗体，待检样本中的抗原会与特异单克隆抗体结合并形成夹心结构，再加入显色剂显色，颜色的深浅和待检抗原的浓度呈正相关，从而实现对GM抗原的检测。该方法检测步骤繁琐，且单克隆抗体制备成本高，不利于试剂盒在临床检测中的推广和普及。
技术实现思路
本专利技术一方面提供一种能够产生抗曲霉菌半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM)抗原之单克隆抗体的杂交瘤细胞或其传代细胞。该杂交瘤细胞于2017年4月18日提交于中国科学院微生物研究所(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏编号为CGMCCNo.13827。本专利技术还提供单克隆抗体或其特异性抗原结合片段，其中单克隆抗体由上述杂交瘤细胞所产生。该单克隆抗体或其特异性抗原结合片段能够可以与曲霉菌GM抗原特异性结合。示例性的，特异性抗原结合片段包括ScFv、(Fab’)2、Fab、Fv、scFv、双抗体、线性抗体或多特异性抗体等。本专利技术还提供上述单克隆抗体的制备方法，其包括腹水的制备，单克隆抗体的纯化，其纯化方法包括饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法。本专利技术还提供用于检测GM抗原的检测试剂及其检测方法，该检测试剂包括上述的单克隆抗体或其特异性抗原结合片段。在其检测GM抗原时，可采用竞争ELISA法，即：a)将GM抗原包被在固相载体上；b)将待检样本处理后与标记酶的抗GM抗原单克隆抗体加入固相载体，使待检样本中的抗原与包被后的抗原竞争结合有限的抗体结合位点；或者，将待检样本处理后与未标记酶的抗GM抗原单克隆抗体加入固相载体，使待检样本中的抗原与包被后的抗原竞争结合有限的抗体结合位点，恒温反应并彻底洗涤，加入酶标二抗；c)经过恒温反应并彻底洗涤，再加入酶的底物溶液显色，颜色的深浅和待检样本中GM浓度呈负相关；d)用酶标仪在一定波长下测定吸光度(A值)，通过标准曲线实现对抗原的检测。本专利技术还提供一种检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括上述单克隆抗体或其特异性抗原结合片段。该试剂盒检测曲霉菌GM抗原系采用竞争ELISA法。具体的，所述试剂盒包括GM抗原包被的固相载体、抗GM抗原单克隆抗体和GM抗原标准品。在本专利技术一具体实施方式中，所述固相载体为酶标板、微孔板、试管或微孔滤膜，优选的，所述固相载体为酶标板；固相载体的材质例如可为聚苯乙烯、硝酸纤维素、尼龙等。在本专利技术一具体实施方式中，所述抗GM抗原单克隆抗体为标记酶的抗GM抗原单克隆抗体；优选的，所述抗GM抗原单克隆抗体为标记酶的兔源抗GM抗原单克隆抗体。或者，所述抗GM抗原单克隆抗体为未标记酶的抗GM抗原单克隆抗体，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗可与抗GM抗原单克隆抗体相结合；优选的，所述抗GM抗原单克隆抗体为未标记酶的兔源抗GM抗原单克隆抗体，所述试剂盒还包括酶标羊抗兔二抗。其中，所述酶为辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)、碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，AP)或葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase，GO)；优选的，所述酶为辣根过氧化物酶。在本专利技术一具体实施方式中，所述GM抗原标准品包括至少三种已知浓度的GM抗原溶液，所述GM抗原标准品的浓度在0-50ng/mL范围内。优选的，所述GM抗原标准品的浓度在0-10ng/mL范围内，最优选的，在0-5ng/mL范围内。在本专利技术一具体实施方式中，所述试剂盒还包括样本处理液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液中的一种或多种。其中所述样本处理液选自0.03mol/LEDTA、0.1mol/LEDTA、0.12mol/LEDTA、0.05mol/L蛋白酶K、0.1mol/L蛋白酶K、0.2mol/L蛋白酶K、5％DMSO、15％DMSO或30％DMSO。优选的，所述样本处理液为0.12mol/LEDTA。所述试剂盒的制备方法包括：1)GM抗原包被的固相载体的制备；2)标准品的配制；3)抗GM抗原单克隆抗体的制备。其中，步骤1)中又包括配制GM抗原包被液、配制封闭液和包被酶标板。所述GM抗原包被液的缓冲液选自由0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LPBS、0.05mol/LCBS、0.1mol/LCBS、0.2mol/LCBS和生理盐水组成的组。优选的，GM抗原包被液的缓冲液为0.1mol/LTris-HCl，其pH6.0-pH9.0；所述的封闭液选自由2％新生牛血清、5％新生牛血清和8％新生牛血清组成的组。优选的，封闭液为8％的新生牛血清，其将新生牛血清加入生理盐水中，配制成封闭液；本专利技术还提供单克隆抗体或其特异性抗原结合片段在制备用于检测曲霉菌感染的检测试剂或检测试剂盒中的用途，所述单克隆抗体由保藏本文档来自技高网...

【技术保护点】
杂交瘤细胞或其传代细胞，其中所述的杂交瘤细胞的保藏号为CGMCC No.13827。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.杂交瘤细胞或其传代细胞，其中所述的杂交瘤细胞的保藏号为CGMCCNo.13827。2.单克隆抗体或其特异性抗原结合片段，其中所述的单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞所产生，所述特异性抗原结合片段能特异性结合曲霉菌GM抗原。3.根据权利要求2所述的抗体或其特异性抗原结合片段，其中所述特异性抗原结合片段包括选自由ScFv、(Fab’)2、Fab、Fv、scFv、双抗体、线性抗体和多特异性抗体组成的组。4.检测试剂，其包含权利要求2或3所述的抗体或其特异性抗原结合片段。5.检测试剂盒，其包括权利要求2或3所述的抗体或其特异性抗原结合片段。6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述试剂盒还包括包被液的缓冲液、封闭液和/或样本处理液。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述包被液的缓冲液选自由0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LPBS、0.05mol/LC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春龙，彭洁，张舟，翟栓柱，李宁，粟艳，周泽奇，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12