Blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了Blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术以原核表达的Blec蛋白为免疫原免疫鼠，将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经过多次筛选和亚克隆，获得特异性的单克隆细胞株blec‑3D3以及由其分泌的单抗blec‑3D3。利用单抗blec‑3D3对鸡外周血淋巴细胞进行流式细胞术检测，结果表明blec蛋白主要表达于CD3+和CD4+细胞；免疫组化检测结果表明，单抗blec‑3D3能在鸡黏膜免疫相关组织检测到特异性信号。本发明专利技术提供的blec单抗可作为检测抗体检测动物组织或细胞内的Blec蛋白的分布、表达或生物学功能。

【技术实现步骤摘要】
Blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及鸡C-型凝集素样受体蛋白Blec单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本专利技术进一步涉及它们在检测blec蛋白的组织学分布、体内和体外表达中的应用，属于鸡凝集素样受体蛋白Blec单克隆抗体的制备和应用领域。
技术介绍
鸡blec基因位于主要组织相容性复合体(Majorhistocompabilitycomplex,MHC)的核心区域，在不同单倍型之间保守性较强。根据编码蛋白的推导氨基酸序列分析，为C-型凝集素样结构，可能与鸡的自然杀伤细胞非MHCI类分子介导的细胞杀伤功能有关。但至今blec蛋白的结构、在鸡体内的组织学分布尚未见明确报道。利用Blec蛋白特异性单克隆抗体，可通过免疫组织化学技术分析鸡体内blec蛋白的组织学分布，这对于研究blec蛋白的结构、生物学功能以及在鸡体内的组织学分布具有重要的价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一株稳定分泌Blec蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本专利技术所要解决的第二个技术问题是将该杂交瘤细胞株分泌的Blec蛋白单克隆抗体应用于检测鸡体内的Blec蛋白的表达或分布。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术为获得MHC单倍型鸡保守的blec蛋白特异性单抗，并适合于blec蛋白功能研究，本专利技术根据网上公布的所有不同单倍型鸡Blec基因序列，比对推导氨基酸序列结果，发现存在5个变异位点，为了获得适用于表面配体功能分析的单抗，本专利技术最终确定选择Ala59-Leu176区域进行表达。选择最保守的B21单倍型鸡为实验材料，参考标准序列设计引物，扩增blec胞外区(Ala59-Leu176)基因，构建pET-Blec21重组质粒，以保证获得型通用型单抗。IPTG诱导pET-blec21原核表达重组菌，超声波破碎，用盐酸胍处理，获得包涵体；在复性液中复性，浓缩，凝胶过滤层析柱中纯化蛋白，获得纯化的Blec蛋白。取7周龄无特定病原体BALB/c雌性小鼠，用纯化的blec蛋白进行免疫，50μg/小鼠，腹腔注射。每隔2周免疫一次，第3次免疫后一周采集免疫鼠血，37℃放置1h，4℃离心10min分离血清。将血清倍比稀释，用间接ELISA检测血清效价，选择血清效价最高的小鼠于融合前3天加强免疫。将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经过3次筛选和3次亚克隆，获得特异性强、稳定性好的单克隆细胞株blec-3D3。本专利技术对单克隆细胞株blec-3D3进行亚类鉴定，鉴定结果显示，blec-3D3的重链是IgM，轻链为Kappa链。Westernblot鉴定结果表明，blec-3D3能特异性检测到鸡体内黏膜免疫相关组织中的Blec蛋白。本专利技术将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株blec-3D3提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.12998；分类命名为：BALB/c小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2016年10月26日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。流式细胞术检测结果表明，应用本专利技术的Blec单抗可用于检测鸡外周血中表面表达blec蛋白的细胞种类。免疫组化检测结果表明，应用本专利技术的Blec单抗可用于检测鸡体内blec蛋白的组织学分布。附图说明图1为鸡blec基因胞外区与人和小鼠C-型凝集素受体家族2型(CLEC2)的氨基酸序列同源性比较结果。图2为BlecHiload16/60SuperdexTM75pregrade[global]纯化结果。图3为blec-3D3细胞上清对原核表达产物的Westernblot鉴定结果：1：pET-30a载体转化菌；2：pET-Blec重组质粒转化菌。图4为应用本专利技术Blec单抗采用流式细胞术检测鸡外周血淋巴细胞表面blec蛋白的表达结果。图5为应用本专利技术Blec单抗进行免疫组化检测鸡blec蛋白组织分布的结果。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本专利技术的保护范围。实施例1MHC‐B单倍型鸡C‐型凝集素样受体蛋白blec单抗细胞株的构建和鉴定1.免疫原blec蛋白型保守区域的选择为获得MHC单倍型鸡保守的blec蛋白特异性单抗，并适合于blec蛋白功能研究，本专利技术根据网上公布的所有不同单倍型鸡Blec基因序列，比对推导氨基酸序列结果，存在5个变异位点(下表中加粗下划线表示)。选择最保守的B21单倍型鸡为实验材料，参考序列设计引物，扩增blec基因，构建pET-Blec21重组质粒，以保证获得型通用型单抗。表1鸡不同单倍型Blec基因推导氨基酸的突变位点MHCB单倍型氨基酸位点对Blec蛋白胞外区C型凝集素样结构域序列的进化分析结果表明，其与结构已解析的人和小鼠C-型凝集素样结构域第2亚群(CLEC2)家族相似度较高(图1)。由于哺乳动物的CLEC2具有自然杀伤细胞(NK细胞)配体的作用，推测鸡blec蛋白也可能是鸡NK细胞的配体。为了获得适用于表面配体功能分析的单抗，本专利技术选择Ala59-Leu176区域进行表达。2.blec基因的扩增与原核表达根据NCBI公布的MHC-B21单倍型鸡blec序列(NCBIacc.No:AM950195)设计一对引物：上游：5′-CCATATGGCGCAGTGCCCGTTCGATTGGATTG-3′，下游：5′-CCCTCGAGTTACAACGCGGGTTTGGTGCAAACC-3′，以无特定病原体(Specificpathogenfree，SPF)B21单倍型鸡外周血淋巴细胞总RNA为模板，RT-PCR反应获得blec胞外区(Ala59-Leu176)cDNA，克隆入大肠杆菌表达载体pET-30a，转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，构建成功原核表达重组质粒pET-blec21；所表达的氨基酸序列为：MAQCPFDWIGFGGKCYYFSEDESNWTSSQNNCSALGASLAVFDSAEDLSFTMRHKGSSPHWVGLSREGKEHPWEWVNRSPLSHLFQVQGDGLCAYLGDAGLSSSHCSARRNWVCTKPAL(SEQIDNo.1)；3.免疫原形式的筛选为获得结合力强、特异性好的单抗，采用2种途径制备免疫原，根据被免小鼠的血清抗体效价，选择效价高的被免小鼠进一步制备单抗。3.1SDS-PAGE凝胶条免疫大量培养、诱导表达pET-blec21重组菌，按照包涵体的提取方式，进行超声波破碎、离心，与5×上样缓冲液混匀、煮沸后，进行SDS-PAGE电泳。采用没有梳齿的上样条，上样。电泳结束后，常规考马斯亮蓝染液染色30min，沸水浴30min脱色，期间多次换水，直至背景清亮无色，目的带清晰。根据标准分子量，用75％乙醇擦拭消毒过的刀片，准确切下目的条带。尽量碾碎后，用PBS重悬，作为免疫原。3.2Blec蛋白纯化产物免疫IPTG诱导pET-blec21原核表达重组菌，菌体6000r本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株稳定分泌Blec蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12998。

【技术特征摘要】
1.一株稳定分泌Blec蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.12998。2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的Blec蛋白单克隆抗体。3.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备检测Blec蛋白在动物组织或细胞内表达或组织学分布试剂中的应用。4.权利要求2所述blec蛋白单克隆抗体在制备检测Blec蛋白在动物组...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩凌霞，廉传江，赵丽丽，张圆圆，陈洪岩，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23