分泌抗人B7‑H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人B7‑H4单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及免疫应用技术领域，具体涉及分泌抗人B7‑H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人B7‑H4单克隆抗体及其应用，杂交瘤细胞株包括五株能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞，具有良好的传代能力。抗体为分泌抗人B7‑H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。抗体能够识别人B7‑H4的原核表达产物、真核表达产物，及表达胞外功能区蛋白。该抗体应用于B7‑H4的免疫学检测，包括采用流式细胞术检测细胞表面表达B7‑H4，采用免疫组织化学技术和Western blot技术检测组织或细胞中表达的B7‑H4，采用免疫荧光技术、ELISA和化学发光免疫检测可溶性B7‑H4；也用于抗体药物设计。

The secretion of extracellular H4 anti human B7 monoclonal antibody hybridoma cell lines and H4 anti human B7 monoclonal antibody and its application

The present invention relates to the technical field of immune application, in particular to secrete anti human H4 extracellular B7 hybridoma cell lines of monoclonal antibodies and anti human B7 monoclonal antibody and its application H4, hybridoma cell hybridoma cell lines including five strains can produce high titer monoclonal antibody, has good ability of passage. Monoclonal antibody for antibody secreting anti human B7 monoclonal antibody extracellular H4 produced by hybridoma cell lines. Prokaryotic expression, eukaryotic expression products of B7 antibody can recognize human H4, and the protein expression of the extracellular domain. The immunological detection of antibody used in B7 H4, including the use of flow cytometry to detect the surface expression of B7 H4 expression by immunohistochemical technique and Western blot technique to detect tissues or cells in B7 H4 by immunofluorescence, ELISA and chemiluminescence assay of soluble B7 for H4; antibody drug design.

【技术实现步骤摘要】
分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人B7-H4单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及免疫应用
，具体涉及分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人B7-H4单克隆抗体及其应用。
技术介绍
双信号学说认为T细胞活化需要抗原信号和共刺激信号，前者由T细胞表面TCR识别抗原提呈细胞中MHC结合抗原肽而传递，后者由共刺激/共抑制分子及其配体相互作用而实现，两种信号的整合可有效诱导T细胞活化。共刺激/共抑制分子包括一大群已知的和未知的表达于抗原提呈细胞和T细胞表面的膜分子，主要有免疫球蛋白超家族（Igsuperfamily，IgSF）和TNF超家族（TNFsuperfamily），这些分子在维持机体免疫平衡、决定T细胞免疫应答方向（应答或耐受）中起十分重要的作用，它们被称为免疫监测分子（immunecheckpointmolecules），包括刺激性免疫监测分子（stimulatorycheckpointmolecules，SCPM）和抑制性免疫监测分子（inhibittorycheckpointmolecules，ICPM），抑制性免疫监测分子对T细胞活化起负调节作用，如CD80/CD86-CTLA4、PD-L1-PD1、B7-H4及其受体、B7-H3及其受体、HVEM-BTLA等，在维持机体外周免疫平衡中起十分重要作用，其中CTLA-4和PD-1，尤其是后者已经作为肿瘤免疫治疗靶点在肿瘤治疗中得到应用。B7-H4（(B7x,B7S1,VTCN1)）是2003年发现的一种抑制性免疫监测分子，属于IgSF，人与小鼠的B7-H4有87%的氨基酸序列同源，成熟的B7-H4是一种50~80kDa的跨膜蛋白，拥有一个IgV区和一个IgC区，其mRNA可表达于淋巴组织和非淋巴组织，正常情况下其蛋白质在免疫细胞和非淋巴组织中不表达，但可诱导性表达于树突状细胞（DC）、单核/巨噬细胞、B细胞和T细胞等细胞表面。膜结合型B7-H4和可溶性B7-H4-Ig融合蛋白均可有效抑制T细胞活化，其效应为：抑制T细胞（包括CD4+和CD8+细胞）增殖和产生IL-2；阻滞T细胞的细胞周期；抑制CTL杀伤活性。在小鼠EAE模型中，采用B7-H4单抗和可溶性B7-H4-Ig融合蛋白阻断B7-H4信号途径可加重疾病的进展，但B7-H4缺陷小鼠仅表现轻度的Th1细胞活性升高，而细胞毒性T细胞功能不变，提示，B7-H4是一种T细胞活化的免疫抑制分子，但其作用较弱，可起到优化微调免疫功能的作用。最近，发现B7-H4与Treg免疫抑制功能发挥及中性粒细胞抗感染活性相关，如发现局部表达B7-H4可抑制受者对移植胰岛的同种移植排斥反应，并与提高Treg活性有关，采用B7-H4-Ig治疗NOD小鼠可抑制自身免疫性糖尿病的发生，其机制与抑制效应T细胞浸润和提高Treg细胞活性有关。还发现人骨髓间充质干细胞和胆管上皮细胞均高表达B7-H4，并且B7-H4的高表达与这些细胞的免疫抑制功能及抗凋亡作用关系密切。上述结果说明B7-H4信号途径对固有免疫细胞和适应性免疫细胞的功能均起负向调节作用，在维持机体内环境平衡中起重要作用。近年来研究发现，B7-H4在多种肿瘤细胞中，如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、肾癌、黑色素瘤等癌细胞表面呈高表达，B7-H4的表达与肿瘤的分型、分期和预后密切相关。而且在肿瘤的血管内皮细胞和肿瘤浸润性巨噬细胞和树突状细胞表面也高表达。采用免疫组织化学技术检测了肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌等患者肿瘤组织中B7-H4的表达，发现上述肿瘤组织均高表达B7-H4。B7-H4也可以可溶性形式（solubleB7-H4,sB7-H4）存在于人的血液和其他体液中，即缺乏跨膜区和膜内区，有关可溶性B7-H4的产生机制尚不完全清楚。已经发现多种肿瘤患者外周血中sB7-H4水平升高，采用多抗-单抗配对建立了检测sB7-H4的ELISA夹心法，通过对600余例不同肿瘤患者外周血的检测，发现多种肿瘤患者外周血中sB7-H4水平升高，而且sB7-H4水平与肿瘤的分型、分期和预后均密切相关。因此，B7-H4被认为是一种新型广谱肿瘤标志物。目前，发现B7-H4与肿瘤的免疫逃逸关系密切。Miyatake等发现乳腺癌组织中B7-H4表达强度与浸润性CD4+和CD8+T细胞的数量呈反比，提示B7-H4可抑制T细胞向肿瘤组织中浸润。而肿瘤微环境中肿瘤相关性巨噬细胞（tumorassociatedmacrophage,TAM）高表达B7-H4，并与Treg构成负向免疫调节环路，有利于肿瘤的免疫逃逸，Salceda等发现表达B7-H4人卵巢癌细胞株在SCID小鼠体内的生长迅速，并增强肿瘤细胞的抗凋亡作用；还发现，表达B7-H4可使上皮细胞发生恶性转化，与肿瘤细胞的增殖、粘附、转移和侵袭性关系密切。值得一提的是，B7-H4对T细胞活化的抑制效应不能被B7-CD28共刺激途径逆转，提示机体正常的免疫系统无法通过自身的作用阻断B7-H4介导的免疫逃逸，因而无法自主产生有效的抗肿瘤免疫反应。上述结果说明B7-H4参与介导肿瘤免疫逃逸，是一个理想的肿瘤免疫治疗的靶标。已有研究发现采用siRNA下调B7-H4表达能阻断肿瘤免疫逃逸，最近Sun等采用B7-H4特异性shRNA沉默B7-H4在肺癌细胞系A549细胞表达，将该细胞与Jurkat细胞共培养，结果显示沉默B7-H4基因的表达可促进Jurkat细胞增殖、抑制其凋亡、促进细胞周期进程和诱导IFN-γ、IL-10和IL-2的产生。除肿瘤以外，BTLA在自身免疫性疾病、感染性疾病等免疫相关性疾病中的作用也有报道。发现类风湿关节炎患者外周血和关节液中sB7-H4水平升高，且与疾病严重程度呈正相关，胶原诱导的小鼠关节炎模型中，过度表达sB7-H4和敲除B7-H4基因均导致疾病严重程度增高，提示sB7-H4可以作为诱骗受体竞争剂阻断B7-H4的信号传递。此外，胰岛细胞中高表达B7-H4可以抑制自身反应性T细胞的活化，从而保护胰岛细胞，还发现B7-H4与糖尿病、移植排斥反应等相关。另外，B7-H4基因修饰可使小鼠胰岛细胞在糖尿病小鼠体内的存活时间明显延长；可溶性B7-H4-Ig能通过下调IL-2、IFN-γ、IL-4和上调IL-10的表达来抑制ConA诱导的肝损伤。B7-H4在抗感染免疫中的作用也有报道，国内学者发现慢性乙型肝炎和肝功能衰竭患者肝脏组织中CD3+T细胞、巨噬细胞、胆管细胞和内皮细胞高表达B7-H4，在急性链球菌感染小鼠模型中发现B7-H4缺陷小鼠对急性链球菌导致的肺部感染具有较好的耐受性。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于针对现有技术的不足，提供分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株。本专利技术的目的之二在于针对现有技术的不足，提供抗人B7-H4单克隆抗体。本专利技术的目的之三在于针对现有技术的不足，提供抗人B7-H4单克隆抗体的应用。为了实现上述目的之一，本专利技术采用如下技术方案：提供分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株，包括五株能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞，均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉大学，保藏日期是2017年4月19日，命名和保藏编号分别为：（1）培养物名称（分类命名）：杂本文档来自技高网...

【技术保护点】
分泌抗人B7‑H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：包括五株能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞，均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉大学，保藏日期是2017年4月19日，命名和保藏编号分别为：（1）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株1C1H11，保藏编号：CCTCC NO:C201758；（2）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株3E5G7， 保藏编号：CCTCC NO:C201759；（3）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株8H3C4 ，保藏编号：CCTCC NO:C201760；（4）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株12B2E1，保藏编号：CCTCC NO:C201761；（5）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株12H6G1，保藏编号：CCTCC NO:C201762。

【技术特征摘要】
1.分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：包括五株能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞，均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉大学，保藏日期是2017年4月19日，命名和保藏编号分别为：（1）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株1C1H11，保藏编号：CCTCCNO:C201758；（2）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株3E5G7，保藏编号：CCTCCNO:C201759；（3）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株8H3C4，保藏编号：CCTCCNO:C201760；（4）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株12B2E1，保藏编号：CCTCCNO:C201761；（5）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株12H6G1，保藏编号：CCTCCNO:C201762。2.抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐军发，余诗炎，庄泽刚，张俊爱，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44