一株分泌抗泰拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3及其应用，可用于食品中泰拉霉素残留的检测，属于免疫化学技术领域。本发明专利技术通过常规的细胞融合技术制备了一株鼠源的单克隆细胞株1B3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13098。该细胞株1B3分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，对泰拉霉素的IC50为0.79μg/L。对牛奶中泰拉霉素的回收率范围为93.29%～112.31%，为食品中泰拉霉素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
A hybridoma cell line 1B3 secreting monoclonal antibody against Tara and its application
A hybridoma cell line 1B3 secreting monoclonal antibodies against Tara monoclonal antibody and its application can be used for the detection of Tara residues in food, which belongs to the field of immunochemical technology. The present invention by conventional cell fusion technique for a murine monoclonal cell line 1B3 was prepared, has been preserved in bacterial China culture preservation Management Committee for the preservation of CGMCC No.13098. The monoclonal antibody secreted by the cell line 1B3 was determined by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the IC50 for Tara was 0.79 g/L. The recovery rate of Tara in milk ranges from 93.29% to 112.31%, which provides the raw material for the immunoassay of Tara residues in food, and has practical application value.
【技术实现步骤摘要】
一株分泌抗泰拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3及其应用
本专利技术涉及一株分泌抗泰拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3及其应用，可用于食品中泰拉霉素残留的检测，属于免疫化学
技术介绍
泰拉霉素（Tulathromycin，TULA）是近年新上市的为动物专用的大环内酯类半合成抗生素。我国农业部在2008年第957号公告中首次批准使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放线杆菌、支原体、巴氏杆菌、副嗜血杆菌引起的猪、牛的呼吸系统疾病，具有用量少、一次给药、低残留、动物专用等优点。我国广泛使用的大环内酯类药物为泰乐菌素和替米考星,虽然这两种药物的使用效果良好,但随着使用时间的延长,在很多地区出现了不同程度的耐药性,而泰拉霉素药效强于泰乐菌素、替米考星和氟苯尼考等市场广泛使用的大环内酯类药物，因此，泰拉霉素必将在畜禽生产中大量使用。作为一种新药，泰拉霉素的残留检测方法的研究尤为必要。目前，大环内酯类药物残留检测方法有酶联免疫分析方法（ELISA）筛选法、薄层色谱法、气质联用法、高效液相色谱和高效液相色谱串联质谱法等，关于泰拉霉素的残留检测多数都是借助于仪器。但是这些方法昂贵、耗时、需要专业的人员来操作。酶联免疫分析方法（ELISA）是一种半定量的、简单、灵敏、快捷和高通量的检测方法，对于食品中药物残留的检测有重要意义。目前没有关于抗泰拉霉素单克隆抗体的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株分泌抗泰拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3及其应用，并在此基础上建立ELISA方法。抗泰拉霉素单克隆抗体是通过小鼠免疫泰拉霉素免疫原获得。以泰拉霉素为原料，通过丁二酸酐法衍生出羧基，再利用羧基与载体蛋白偶联获得免疫原，包被原通过羰基咪唑法合成。筛选血清阳性高抑制好的小鼠取脾脏，将脾细胞与Sp2/0瘤细胞融合。融合后用间接ELISA方法检测细胞上清，筛选对阳性高且对泰拉霉素抑制好的细胞进行亚克隆，进行三次亚克隆，获得纯的细胞株。将细胞株注射进打过石蜡油的小鼠的腹腔制备腹水，获得的腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化。测定单克隆抗体对泰拉霉素的半数抑制浓度(IC50)，以及对其结构类似物的IC50，计算交叉反应率。将泰拉霉素药物添加入牛奶中，进行样本添加回收实验，计算回收率。本专利技术的技术方案：一株分泌抗泰拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.13098，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。抗泰拉霉素单克隆抗体，其是由保藏编号CGMCCNo.13098杂交瘤细胞株1B3分泌产生，其IC50为0.79μg/L。所述抗泰拉霉素单克隆抗体的应用，用于食品中泰拉霉素残留检测中的应用。本专利技术的有益效果：采用间接竞争ELISA测定细胞株1B3分泌的单克隆抗体对泰拉霉素的IC50为0.79μg/L。对牛奶中泰拉霉素的回收率范围为93.29%～112.31%。为动物性食品中泰拉霉素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：分泌抗泰拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.13098，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。附图说明图1是1B3分泌的单克隆抗体对泰拉霉素的标准抑制曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1半抗原的合成以泰拉霉素为原料，通过丁二酸酐引入羧基获得半抗原。100mg泰拉霉素溶解于3mL无水吡啶中，加入150mg丁二酸酐，60℃回流反应8h，氮气吹干反应液得到泰拉霉素衍生物，即为半抗原。实施例2免疫原和包被原的合成免疫原通过碳二亚胺法合成：20mg泰拉霉素半抗原溶解于4mL无水DMF溶液中，加入9.55mgEDC和5.75mgNHS，室温搅拌4h进行活化。40mg牛血清白蛋白溶解于5mL碳酸盐缓冲溶液，将活化好的半抗原加入蛋白溶液中，反应过夜。反应结束后，透析3天，得到免疫原。包被原通过羰基咪唑方法合成：10mg泰拉霉素（TULA）溶解于2mL无水DMF中，加入3mg羰基咪唑（CDI），60℃活化30min。23mg鸡卵清白蛋白（OVA）溶解于4mL碳酸盐缓冲溶液中，将活化好的泰拉霉素加入蛋白溶液中，60℃反应6h。反应结束后，透析三天，得到包被原TULA-CDI-OVA。实施例3小鼠免疫免疫原用生理盐水稀释到合适的浓度，再与等量的弗氏佐剂乳化，在6～8周龄的BALB/c小鼠的背上进行多点注射。首次免疫用的是弗氏完全佐剂，剂量为100μg。后面的四次加强免疫用的是弗氏不完全佐剂，免疫剂量为50μg，免疫间隔为21天。第三次免疫后，通过小鼠的尾静脉采血，并通过间接ELISA来检测血清。第五次免疫后筛选效价高抑制好的小鼠进行腹腔冲刺免疫，三天以后取出小鼠脾脏进行细胞融合。实施例4细胞融合与筛选小鼠脾细胞和瘤细胞在PEG1500的作用下融合形成杂交瘤细胞。融合后第七天进行检测，筛选效价高且对泰拉霉素识别性好的细胞株进行亚克隆，以此类推，进行3次亚克隆获得纯的细胞株1B3。实施例5单克隆抗体的纯化筛选出的细胞株扩大培养后，注射进已经打过石蜡油的小鼠腹腔内，7到14天后可以从小鼠腹腔抽取腹水。腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化，储存在-20℃。实施例6单克隆抗体的性质抗体的灵敏度和特异性通过间接ELISA来测定。1、单克隆抗体的交叉将包被原TULA-CDI-OVA用0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液稀释，100μL/孔，37℃反应2h。包被原浓度为（0.5μg/mL）和单克隆抗体浓度（0.8μg/mL）通过棋盘法确定。将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液PBST洗涤3次，每次3min。拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。酶标板的每孔里加入50μL标准物（TULA）溶液和50μL抗体，在37℃下培养30min后洗涤三次后拍干，每孔加入1︰3000稀释二抗100μL，在37℃下培养30min后洗涤4次后拍干，加入已配制好的TMB显色液100μL，37℃培养15min,最后每孔加入50μL2M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定在450nm处的吸光值。单克隆抗体的交叉实验测定了其他的大环内酯类抗生素：泰乐菌素(Tylosin),替米考星(Tilmicosin),红霉素(Erythromycin),罗红霉素(Roxithromycin),螺旋霉素(Spiramycin),克拉霉素(Clarithromycin),吉他霉素(Kitasamycin),阿奇霉素(Azithromycin),阿维菌素(Avermectin),伊维菌素(Ivermectin)和多拉菌素(Doramectin)交叉反应率为类似物的IC50与泰拉霉素IC50的比值。其交叉实验如表1所示。表1.1B3分泌的单克隆抗体的交叉2.添加回收实验向阴性牛奶中添加泰拉霉素，用单克隆抗体进行检测，计算回收率。添加回收实验见表2。表2.添加回收实验溶液配制：碳酸盐缓冲液（CB本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株分泌抗泰拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.13098，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。
【技术特征摘要】
1.一株分泌抗泰拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.13098，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细...
【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，陈燕妮，匡华，徐丽广，刘丽强，宋珊珊，吴晓玲，胡拥明，郑乾坤，
申请(专利权)人：江南大学，得利斯集团有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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