本发明专利技术公开了一种抗家禽IgY Fc片段的单克隆抗体及应用。该单克隆抗体亚型为小鼠IgG2a，由杂交瘤细胞株LZLPHZ分泌得到，保藏编号为CCTCC NO:C2015188。本发明专利技术所制备的抗IgY Fc片段单克隆抗体不仅能识别鸭IgY Fc片段，还能与鸡、鹅、鸽和鸵鸟等多种禽类血清发生阳性反应，而与猪、兔和牛等哺乳动物血清不反应。说明本发明专利技术制备的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的特点，是一种抗多种禽类IgY的通用型单克隆抗体，可用于多种禽类抗体的检测。本发明专利技术具有上述显著的优点，因此可以广泛应用于相关领域的科学研究，并可用于多种禽类免疫抗体水平的检测或者禽类传染病的快速诊断。
Monoclonal antibody against IgYFc fragment of poultry and its application
The invention discloses a monoclonal antibody against Fc poultry IgY fragment and its application. The monoclonal antibody subtype for IgG2a mice, are secreted by the hybridoma cell strain LZLPHZ and the preservation number is CCTCC NO:C2015188. The prepared anti IgY monoclonal antibody Fc fragment can not only detect the duck IgY Fc fragment, but also with chicken, goose, pigeon and ostrich and other poultry serum positive reaction, and reaction with the pig, rabbit and bovine serum and other mammals. The monoclonal antibody prepared by this method has the characteristics of strong specificity and high sensitivity. It is a universal monoclonal antibody against many avian IgY, and can be used for the detection of avian antibodies. The invention has the obvious advantages, so it can be widely applied to the scientific research in related fields, and can be used for the detection of various avian immune antibody levels or the rapid diagnosis of avian infectious diseases.
【技术实现步骤摘要】
一种抗家禽IgYFc片段的单克隆抗体及应用
本专利技术属于动物分子生物学、免疫学技术应用领域，具体涉及一种抗家禽IgYFc片段的单克隆抗体及应用。
技术介绍
IgY(immunoglobulinofyolk)是存在于鸟类、爬行类和两栖类动物中的、功能与IgG相当的一种免疫球蛋白，其中以禽类IgY研究最多。1893年Klemperer等首次阐明了鸡的被动免疫，指出母源特异性抗体通过蛋黄转移的途径实现对新生鸡的保护作用。1969年Leslie和Clem将存在于禽类及卵黄中的抗体正式命名为IgY。然而这一发现并没有获得重视，一直到二十世纪八十年代，关于IgY的特异性和研究成果才随着商品试剂的广泛使用而受到关注从而被广泛应用。IgY有2条重链和2条轻链，此结构与哺乳动物的免疫球蛋白IgG类似。完整型的IgY分子轻链包括1个可变区(V区)和1个恒定区(C区)，V区是用以识别抗原和决定抗体特异性的部位，而C区氨基酸的数目和顺序则相对恒定。重链包括1个可变区和4个恒定区(CH1、CH2、CH3、CH4)。完整型IgY分子的CH3和CH4区域与IgG的CH2和CH3具有一定的同源性，完整型IgY分子量约为180KDa，其沉降系数为7.8s，重链62～67KDa，轻链22～25KDa。已有研究报道纯化了鸡、鹅、鸵鸟等19种鸟类的IgY，并制备了相应的兔抗禽类IgY的IgG抗体(杨帆，19种抗禽类IgY多克隆抗体的制备和标记)。另外，本实验室曾制备了小鼠抗鸡IgYFc单克隆抗体，具有良好的特异性和敏感性，并应用于鸡的主要传染病的免疫抗体水平检测或疾病的快速诊断，已申报获批了4项国家专利技术专利(一种单克隆抗体，包含该单克隆抗体的检测试剂盒及应用，专利授权号ZL200510011521.8；鸡新城疫抗体免疫胶体金快速检测试剂盒及应用，专利授权号ZL200710169103.0；一种鸡禽流感疫苗免疫与病毒野毒感染的胶体金免疫层析快速鉴别诊断试剂盒及应用，专利授权号ZL200710051442.9；鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试剂盒及应用，专利授权号ZL200710169106.4)，但上述多克隆抗体或本实验室曾研制的小鼠抗鸡IgYFc单克隆抗体均只是针对单一禽类IgY的抗体，无法实现对多种禽类IgY的检测，因此使其应用具有较大的局限性。本专利技术目的在于通过扩增特异性鸭IgYFcCH3CH4基因片段，获得纯化的原核表达重组蛋白，应用杂交瘤单克隆抗体技术，制备一种既可检测鸭IgY也可检测其他禽类如鸡、鹅、鸽、鸵鸟等IgY的单克隆抗体。通过ELISA和Westernblot方法进行检测，结果表明所制备的小鼠抗家禽IgYFc片段的单克隆抗体不仅可与鸭血清反应，还可与鸡、鹅、鸽和鸵鸟等禽类血清发生阳性反应，而与猪、兔和牛等哺乳动物血清不反应。说明所制备的抗家禽IgYFc片段单克隆抗体可作为一种抗禽类IgY的通用抗体试剂，既可以用于相关领域的科学研究中，又可用于ELISA和胶体金免疫层析技术等，研制检测禽类传染病抗体的ELISA或者胶体金试纸条等试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株LZLPHZ，保藏编号为：CCTCCNO：C2015188。本专利技术的第二个目的是获得一种特异性强的抗家禽IgYFc的单克隆抗体。本专利技术最后一个目的在于提供了杂交瘤细胞株LZLPHZ或其分泌的单克隆抗体在制备家禽传染病抗体检测试剂盒中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：本专利技术以纯化后的重组蛋白GST-CH3CH4作为免疫原免疫5～8周龄的Balb/c小鼠，通过杂交瘤筛选出阳性杂交瘤细胞，连续克隆化3次以上，直至所有被检孔均呈阳性反应，才完成该杂交瘤细胞的建株工作，即获得了能稳定传代并分泌预期抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤子细胞系LZLPHZ已于2015年11月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株LZLPHZ，CCTCCNO：C2015188，地址：中国武汉武汉大学。该细胞系的染色体计数结果显示，SP2/0的染色体数为70条，小鼠脾细胞为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在80～94之间，高于两亲本细胞的染色体数目，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。该细胞在含20％新生牛血清的RPMI-1640培养基中生长良好。一种抗家禽IgYFc的单克隆抗体，该单克隆抗体通过杂交瘤细胞株LZLPHZ(CCTCCNO：C2015188)分泌获得。杂交瘤细胞株LZLPHZ或其分泌的单克隆抗体在制备家禽传染病抗体检测试剂盒中的应用，包括利用该细胞株或其分泌的单抗制备成家禽血清检测试剂盒。所述的家禽包括但不限于：鸡、鸭、鹅、鸽和/或鸵鸟。ELISA和Westernblot方法检测结果表明所制备的抗家禽IgYFc片段的单克隆抗体不仅可与鸭血清反应，也可与鸡、鹅、鸽和鸵鸟等多种禽类血清发生反应，而不与猪、兔和牛等哺乳动物血清反应。说明所制备的抗家禽IgYFc片段单克隆抗体可作为一种抗多种禽类IgY的通用型抗体试剂，可以进行酶标记、荧光素标记或生物素标记后应用于相关的科学研究，也可建立如ELISA、胶体金试纸条等方法广泛用于家禽免疫抗体水平的检测和兽医临床禽类传染病的快速诊断。与现有技术相比本专利技术具有如下优点：本专利技术作为一种抗家禽IgY的通用型单克隆抗体试剂，可与多种家禽(鸡、鸭、鹅、鸽和鸵鸟)IgY进行反应，而不与哺乳动物(猪、兔和牛)IgG发生反应，具有特异性强，灵敏度高的特点。附图说明图1是本专利技术的总体技术路线图。图2是本专利技术鸭IgYFcCH3CH4基因扩增、双酶切鉴定图和BLAST比对图。图3-1为GST-CH3CH4的SDS-PAGE检测和Westernblot鉴定图图3-2为His-CH3CH4的SDS-PAGE检测和Westernblot鉴定图图4为本专利技术制备出的杂交瘤细胞染色体计数图。图5为本专利技术制备的小鼠抗IgYFc片段单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE电泳检测图。图6为本专利技术制备出抗IgYFc片段单克隆抗体与禽类血清和哺乳动物血清交叉反应性的Westernblot鉴定图。M：蛋白Marker，1：鸡血清2：鸭血清3：鸽血清4：鹅血清5：鸵鸟血清6：猪血清7：兔血清8：牛血清9：His-CH3CH4重组蛋白。图7为小鼠免疫后的血清抗体效价检测示意图。图8为单克隆抗体亲和力的分析示意图。具体实施方式实施例1：用于制备抗家禽IgYFc片段单克隆抗体的重组蛋白获得1、IgYFcCH3-CH4基因片段的获得本专利技术依据包含有鸭IgYFcCH3-CH4基因片段的pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4质粒(pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4质粒为鸭IgYFcCH1-CH2-CH3-CH4基因片段经PCR扩增后直接连接到pMD-18T载体中)，设计特异性引物(上游引物P1：TATGGATCCTAATCCGGCGCCCAGAGCTGCAG，下游引物P2：CCCAAGCTTTGCGTGCTTGGCGATGCTCTTGC)，P1位于启动子上游，引入了BamHI位点，P2包含有终止密码子，引入了HindIII位点，酶切位点用下划线标出，两个引物之间包含有CH3CH4基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株LZLPHZ，保藏编号为CCTCC NO:C2015188。
【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株LZLPHZ，保藏编号为CCTCCNO:C2015188。2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株LZLPHZ分泌的单...
【专利技术属性】
技术研发人员：李自力，彭慧子，薛雨琴，郭锐，邵雨，胡思顺，毕丁仁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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