本发明专利技术公开了一种检测循环肿瘤细胞的分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：Probe E790：5'‑CCCTACCCTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCGGGTAGGG‑3'，所述分子信标探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。本发明专利技术分子信标探针和试剂盒能够对循环肿瘤细胞进行检测，且检测灵敏度高、检测准确度高。
A molecular beacon probe and kit for detection of circulating tumor cells
The invention discloses a molecular beacon probe for detecting circulating tumor cells, the nucleotide sequence of the molecular beacon probe: Probe E790:5'CCCTACCCTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCGGGTAGGG 3', the molecular beacon probe 5'end labeled with a fluorophore and quencher labeled with 3'. The molecular beacon probe and kit of the invention can detect the circulating tumor cells, and have high sensitivity and high detection accuracy.
【技术实现步骤摘要】
一种检测循环肿瘤细胞的分子信标探针及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学的检测
，具体涉及一种检测循环肿瘤细胞的分子信标探针及试剂盒。
技术介绍
循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTCs)是自发或因诊疗操作，由实体瘤或转移病灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发或远处转移的重要标志。EGFR是表皮生长因子受体。EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活细胞内的激酶信号通路。EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。许多肿瘤中有突变型EGFR基因存在，现已发现许多种EGFR基因突变型。利用EGFR基因突变合成的探针对肿瘤组织中肿瘤细胞的检测和对循环系统中肿瘤细胞的检测具有重要的意义。目前传统的肿瘤诊断方法主要依靠肿瘤组织和肿瘤细胞的形态学特征进行判断，需要对具有一定体积的肿瘤组织进行取样检测，无法实现在肿瘤细胞数量很少时检测其存在，即无法实现肿瘤的早期发现；此外，现有检测方法的检测灵敏度和检测准确度有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种检测循环肿瘤细胞的分子信标探针及试剂盒。为解决以上技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种检测循环肿瘤细胞的分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：ProbeE790：5'-CCCTACCCTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCGGGTAGGG-3'，所述分子信标探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。优选的，所述荧光基团选自FAM、Fluorescein、JOE、TET、HEX、Cyanine3、ROX、TexasRed、Cyanine5或Cyanine5.5，所述淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-2或DABCYL。一种试剂盒，包括上述述的分子信标探针。优选的，上述试剂盒还包括杂交液，每100ml所述杂交液包括以下组分：25mL的50*denhardtt's液，10mL的50*SSC，5mL的50*SSC，100ug/mL的变性鲑精DNA，10g的硫酸葡聚糖。优选的，利用上述杂交液对分子信标进行稀释时，所述分子信标探针的浓度为5pmol/ul。本专利技术还提供一使用上述分子信标探针对循环肿瘤细胞进行检测的方法，该方法所使用的检测标本是血液样本，以EGFR基因突变为分子标记，优选为以EGFR基因突变为分子标记，以相应的分子信标探针进行检测。检测时所使用的细胞固定液组成为：每1000mL中，具有40％甲醛120ml，磷酸二氢钠(NaH2PO4；H2O)4g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)13g，余量为蒸馏水。检测方法包括以下步骤：(1)按照EGFR基因T790M的突变序列设计分子信标探针；该分子信标探针碱基序列为：5'-CCCTACCCTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCGGGTAGGG-3'；(2)取外周血，分离白细胞，(3)将白细胞固定，然后与分子信标探针杂交；(4)在荧光显微镜下观察结果。本专利技术所达到的有益效果：本专利技术分子信标探针和试剂盒能够对循环肿瘤细胞进行检测，且检测灵敏度高、检测准确度高。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1按照EGFR基因T790M的突变序列设计分子信标探针，该分子信标探针碱基序列为：5'FAM-CCCTACCCTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCGGGTAGGG-BHQ13'。该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中5'端标记的是FAM，3'端标记的是BHQ1，荧光基团的激发波长为494nm，发射波长为515nm。然后取外周血2ml，以红细胞裂解液分离白细胞并计数，培养NCI-H1975肺腺癌细胞(携带EGFR基因T790M突变)并计数。将外周血白细胞和培养的肿瘤细胞按照比例混合，分别为单纯外周血白细胞、单纯的肺腺癌细胞、1:100的比例加入肺腺癌细胞。将细胞以10％福尔马林(即1份甲醛溶液加9份水配制而成)250ul固定液固定5分钟，以1xPBS500ul洗2次，最后3000rpm离心5分，弃掉上清，将经热变性的分子信标探针以1xDNA杂交液稀释到5pmol/ul，加200ul使细胞悬浮，42℃孵育15分钟。滴加细胞在载玻片，直接在荧光显微镜下观察并照相，计算荧光显色细胞的比例。结果不加肺腺癌细胞的白细胞无荧光染色，单纯的肺腺癌细胞全部都有荧光染色，加入携带EGFR基因T790M突变肿瘤细胞时，可以观察到细胞荧光染色细胞与无荧光染色的细胞的比例是1:100。每100ml上述DNA杂交液包括以下组分：25mL的50*denhardtt's液，10mL的50*SSC，5mL的50*SSC，100ug/mL的变性鲑精DNA，10g的硫酸葡聚糖。实施例2循环肿瘤细胞(CTCs)富集操作步骤：严格执行采血标准采血并用ACD抗凝剂抗凝，于清晨空腹采集患者肘正中静脉血5ml。取4ml全血加入10倍浓缩PBS、BSA缓冲液进行红细胞裂解，加入磁微粒洗液，每份100ul，离心20min。再加入3ml金属盐、PBS混合液，室温下300r/min离心5min，溶液分为3层，吸取上2层溶液至15ml的离心管中，加10倍浓缩的PBS、BSA缓冲液至14ml，混匀后1000r/min，室温离心5min，弃上清至300ul。转移到2ml离心管，置于磁力架上2～3min，将液体移至1.5ml离心管，室温2000r/min，离心3min，弃上清至100ul，即得循环肿瘤细胞(CTCs)悬浮液。上述富集的循环肿瘤细胞经细胞DNA提取试剂盒提取DNA，以此DNA为模板进行PCR扩增EGFR基因片段，对扩增的EGFR基因用DNA测序确认是否存在EGFR基因T790M突变。将经DNA测序确认含有EGFR基因T790M突变样本(40例)循环肿瘤细胞(CTCs)悬浮液作为金标准阳性；而经DNA测序确认不含有EGFR基因T790M突变样本(40例)循环肿瘤细胞(CTCs)悬浮液作为金标准阴性。用分子信标探针ProbeE790与荧光标记寡核苷酸探针ProbeE790c进行试验。分子信标探针实验步骤:将循环肿瘤细胞(CTCs)悬浮液以10％福尔马林(即1份甲醛溶液加9份水配制而成)250ul固定液固定5分钟，以1xPBS500ul洗2次，最后3000rpm离心5分，弃掉上清，将经热变性的分子信标探针以1xDNA杂交液稀释到5pmol/ul，加200ul使细胞悬浮，42℃孵育15分钟。在荧光显微镜下读片。荧光标记寡核苷酸探针ProbeE790c：5'-FAM-TGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCC-3普通荧光标记寡核苷酸探针实验步骤:(1)将循环肿瘤细胞(CTCs)样本涂片用冰丙酮(-20℃)固定后室温下干燥。(2)将荧光标记寡核苷酸探针用杂交液(2xSSC、50％甲酰胺、10％硫酸葡萄糖)稀释至终浓度为5pmol/ul，75℃变性5min，滴加在玻片上样本的位置，加盖玻片并封闭，然后在50℃下孵育30～45分钟；(3)将玻片依次用洗液A(2xSSC、50％甲酰胺)、洗液B(10mMPBSpH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测循环肿瘤细胞的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：Probe E790：5'‑CCCTACCCTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCGGGTAGGG‑3'，所述分子信标探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。
【技术特征摘要】
1.一种检测循环肿瘤细胞的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：ProbeE790：5'-CCCTACCCTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCGGGTAGGG-3'，所述分子信标探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。2.根据权利要求1所述的一种检测循环肿瘤细胞的分子信标探针，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、Fluorescein、JOE、TET、HEX、Cyanine3、ROX、TexasRed、Cyanine5或C...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙喜元，王季武，
申请(专利权)人：苏州承美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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