GLUT‑1在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开的葡萄糖转运体‑1(GLUT‑1)在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用，以诱导分化的脂肪细胞为对象，采用定量反转录聚合酶链式反应(qRT‑PCR)检测经不同浓度的人重组FGF21蛋白处理后脂肪细胞内葡萄糖转运体‑1基因表达水平的升高程度，进而确定人重组FGF21蛋白的活性。本发明专利技术发现葡萄糖转运体‑1基因表达水平与所用人重组FGF21蛋白浓度之间存在良好的量效关系，从而确定脂肪细胞内葡萄糖转运体‑1基因表达水平成为人重组FGF21蛋白活性检测的新指标，该方法操作过程简单，对环境的要求低，有很好的实用价值。

GLUT 1 in the detection of recombinant human FGF21 protein activity in the application

The invention discloses a glucose transporter 1 (GLUT 1) used in the detection of recombinant human FGF21 protein activity in the induction of differentiation in fat cells as the object, using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT PCR) in adipocyte glucose transporter 1 gene increased the expression level of the recombinant human FGF21 protein. After different concentration detection, in order to determine the activity of recombinant human FGF21 protein. The present invention found that glucose transporter 1 gene expression level with the existing good dose effect relationship between recombinant human FGF21 protein concentration, so as to determine the expression level as a new index detection of recombinant human FGF21 protein activity of glucose transporter 1 gene fat cells, the method has simple operation process, low requirement to environment, have very good practical value.

【技术实现步骤摘要】
GLUT-1在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用
本专利技术属于葡萄糖转运体应用
，具体涉及一种GLUT-1在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。
技术介绍
肥胖和2型糖尿病已经成为威胁人类健康的主要疾病，与其相关的新药研制一直是药物研发领域的热点。其中，蛋白类药物的开发表现出良好的前景。成纤维细胞生长因子21(FGF21)是机体肝脏细胞和脂肪细胞等分泌的活性蛋白，FGF21重组蛋白可降低血脂、降低血糖、减轻体重、显著减轻2型糖尿病的病症及其并发症。因此，FGF21成为多家研发公司竞相开发的一个候选药物。在药物研发中，建立一个稳定高效的药物效果检测体系是评价候选药物的关键，因此，建立一个客观评价FGF21重组蛋白治疗糖尿病效果的检测体系也是FGF21研发中的一个重要环节。脂肪细胞是FGF21的靶细胞，FGF21调控脂肪细胞的分化与代谢等功能。脂肪细胞的葡萄糖摄取测定是目前普遍采用的FGF21活性检测方法：该方法在脂肪细胞培养液中加入葡萄糖的类似物2-脱氧葡萄糖，2-脱氧葡萄糖摄入细胞后被己糖激酶磷酸化为6-磷酸-2-脱氧葡萄糖，6-磷酸-2-脱氧葡萄糖因无法进入后续代谢而在细胞中聚集，通过检测6-磷酸-2-脱氧葡萄糖可反映细胞的葡萄糖摄入水平。该方法检测过程中一是使用放射性物质标记2-脱氧葡萄糖，对于实验防护和环境保护要求较高；另外，检测方法中使用荧光检测方法测定6-磷酸-2-脱氧葡萄糖的水平，该方法价格昂贵，不利于高通量筛选使用，同时该检测还受到己糖激酶活性的影响，在酶活性发生变化时不能很好地反映葡萄糖摄取能力变化。因此，研发新的FGF21功能检测的体系不仅可弥补葡萄糖摄取测定的不足，而且有望获得更为简便可靠的检测方法，这对于客观评价人重组FGF21蛋白效果具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种GLUT-1在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用，为判断人重组FGF21蛋白活性提供了新的思路，解决了现有检测方法成本昂贵、对环境要求高的问题。本专利技术所采用的技术方案是，GLUT-1在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。本专利技术的特征在于，GLUT-1与人重组FGF21蛋白的添加浓度关系为：GLUT-1基因表达水平随人重组FGF21蛋白的添加浓度的增加而增大。GLUT-1的基因表达水平通过定量PCR方法检测。定量PCR方法检测过程中，GLUT-1的引物序列为：上游引物：5’-GCCCCCAGAAGGTTATTGA-3’；下游引物：5’-CGTGGTGAGTGTGGTGGAT-3’。本专利技术所采用的另一个技术方案，用于判断人重组FGF21蛋白活性的GLUT-1，GLUT-1基因表达水平被人重组FGF21蛋白浓度上调，且呈剂量依赖性升高。本专利技术的特征还在于，GLUT-1为脂肪细胞内的GLUT-1。本专利技术的应用有益效果是：本专利技术通过不同浓度的人重组FGF21蛋白处理脂肪细胞，采用定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测脂肪细胞内的葡萄糖转运体-1(GLUT-1)基因表达水平，从而确定脂肪细胞内葡萄糖转运体-1表达水平成为人重组FGF21蛋白活性检测的新指标，操作过程简单，对环境的要求低，有很好的实用价值。附图说明图1是本专利技术细胞转变为成熟脂肪细胞的显微图片；图2是本专利技术定量PCR方法中葡萄糖转运体-1和beta-actin基因的扩增曲线图；图3是本专利技术定量PCR方法中PCR产物的溶解曲线；图4是本专利技术人重组FGF21蛋白处理细胞12h后对葡萄糖转运体-1基因表达的影响柱状图；图5是本专利技术人重组FGF21蛋白浓度与葡萄糖转运体-1基因表达水平的量效关系图；图6是人重组FGF21受体抑制剂对人重组FGF21蛋白作用的抑制效应图。具体实施方式本专利技术公开的脂肪细胞内葡萄糖转运体-1(GLUT-1)基因表达水平在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。一、细胞培养和处理小鼠前体脂肪细胞细胞种植于12孔培养板中，在温度为37℃的孵箱培养，所用培养液为普通培养液即DMEM培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清，每2天更换新鲜培养液；当细胞生长至接触抑制2天后，更换到诱导培养液中，诱导培养液为DMEM培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清、0.3IU/ml胰岛素、20μmol/L地塞米松和20μmol/L罗格列酮，处理2天后；更换到胰岛素培养液中，胰岛素培养液为DMEM培养液，其中加入体积分数为10％的新生牛血清和0.3IU/ml胰岛素，继续培养2天后；更换到普通培养液中继续培养，细胞经诱导后可见细胞内脂滴沉积，向脂肪细胞转化，每2天更换新鲜培养液，6天后细胞用于人充重组FGF21蛋白处理。如图1所示，细胞经诱导分化后全部出现脂滴沉积，转变为成熟的脂肪细胞。在脂肪细胞培养液中分别加入不同浓度0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml的人重组FGF21蛋白(美国Peprotech公司产品)，处理12小时后，脂肪细胞用于RNA提取。二、脂肪细胞RNA提取和反转录将12孔板中的培养液去除干净，每孔加入350μL裂解液RL，用细胞研磨棒研磨裂解，再将所有溶液转移至过滤柱CS中以12000rpm的速度离心2min，收集滤液；再向滤液中加入350μL70％乙醇，混匀并转入吸附柱CR3中以12000rpm的速度离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，以12000rpm的速度离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；向吸附柱CR3中加入80μLDNaseI工作液，室温放置15min；向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，以12000rpm的速度离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，以12000rpm的速度离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；重复向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，以12000rpm的速度离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3置于室温放置5min以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱CR3转入RNase-Free离心管中，加入50μLRnase-FreeddH2O，室温放置2min，以12000rpm的速度离心2min，得到RNA溶液。酶标仪检测RNA浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。在八连管中依次加入2μL5xgDNAEraserBuffer，再向其中依次加入1μLgDNAEraser、1μgTotalRNA，最后用RNaseFreedH2O补足至10μL，混匀，室温反应5min。在各管中分别加入以下试剂，4μL5xPrimeScriptBuffer，4μLRNaseFreedH2O，1μLPrimeScriptRTEnzymeMixI，1μLRTPrimerMix，总反应体系为20μL，混匀。反应条件为37℃、15min，85℃、5s。反应完成后将cDNA存于4℃备用，长期保存时转入-20℃。三、葡萄糖转运体-1(GL本文档来自技高网...

【技术保护点】
GLUT‑1在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。

【技术特征摘要】
1.GLUT-1在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的GLUT-1与人重组FGF21蛋白的添加浓度关系为：GLUT-1基因表达水平随人重组FGF21蛋白的添加浓度的增加而增大。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的GLUT-1的基因表达水平通过定量PCR方法检测。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的定量PCR方法检测过程中，GLUT-1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈镝，赵玉峰，苏兴利，梁向艳，魏兰兰，赵妍妍，谢荣，刘英光，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61