一种重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种胶原蛋白生物海绵的制备方法，其包括将含壳聚糖的酸性溶液加入到含胶原蛋白的酸性溶液中，混合均匀后，注入模具，低温冷冻成型，对冷冻成型产物进行冷冻干燥，再浸泡入含原花青素的溶液中交联，洗涤后进行冷冻干燥，获得胶原蛋白生物海绵。本发明专利技术的生物海绵具有成形可控、不含杂质、适宜微孔结构、理化性能良好、生物相容性良好，无动物胶原海绵病毒隐患，且本发明专利技术的生物海绵质量稳定，成本低廉。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法本申请是分案申请，其母案为：母案申请号:2013104033090母案申请日:2013年09月06日母案专利技术名称：一种重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法。
本专利技术属于生物医药
，具体而言，本专利技术涉及一种胶原蛋白生物海绵的制备方法及其所制备的生物海绵。
技术介绍
目前常用的胶原蛋白是从猪皮、牛皮、牛骨、鱼皮、鱼鳞等动物组织中提取而得，分子量不确定、分布范围广，且存在动物病毒隐患、应用于人体时又会产生异体或异种的排异反应等缺点和不足。本专利技术人的前期研究克服了这一缺陷：利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。重组人源胶原蛋白是基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域Gly-X-Y(甘氨酸-X-Y)的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体，通过一系列体外酶切连接，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，转入巴氏毕赤酵母菌，通过高密度发酵和分离、纯化而得。具备网状多孔结构的胶原生物海绵是组织工程中重要的基质材料，可以模拟细胞外基质，利于细胞粘附和渗透，指引细胞分化和增殖以形成功能性目标组织，且对所负载药物具有缓释作用，从而在模拟细胞体内生长环境、建立体外细胞培养模型或者促进创伤的填充、修复、再生方面具有重要应用价值。利用原花青素作为交联剂，有助于提高胶原蛋白与壳聚糖共聚海绵(或支架、膜)的机械性能，即将胶原蛋白和壳聚糖共溶于酸性溶液中，加入原花青素进行交联反应，然后装入模具中成型，但是一般只能形成薄膜形状(参见：林旭明，等.原花青素交联的支架材料的生物相容性研究.眼科新进展.27(4):262；党美珠.天然多酚改性鱼鳞胶原蛋白-壳聚糖膜复合材料的制备及其应用研究.华中农业大学学位论文集，等)。现有技术在生物海绵成型后，要么直接使用，要么于室温或高温干燥，如果其中需要去除利用制备生物海绵时引入的酸，加入氢氧化钠、氨等碱性物质来中和。然而，前者只能临时制备使用，不利于生物海绵的产业化推广应用；而经本专利技术研究发现，后者需要严格控制加入的原花青素的量，否则不利于生物海绵的机械性能。另外，通过加入碱性物质来中和，尽管pH值能达到生理要求，但是会使得生物海绵中残留有铵盐、钠盐等盐，影响其使用范围，在体内或者直接接触伤口的使用中受到了极大的限制。本专利技术人经过长期研究，偶然发现了一种制备流程，先将胶原蛋白和壳聚糖冷冻干燥成型，再使用含乙醇的原花青素溶液来交联，水洗后再冷冻干燥。整个过程都可以使用目前的成熟设备，制备过程对原花青素浓度不敏感，成本投入少，而且能够提高生物海绵的机械性能(如能支撑起蓬松的块状而不溃缩)，尤其是产品成型性好，完全依据模具成型，形成大小、尺寸、形状可控的海绵，尤其是能够形成非薄膜状，另外在此流程中能够去除酸性物质，不留有铵盐、钠盐等盐残留，且易于保存，便于更广泛的产业化推广。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种新的重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法。另外，本专利技术还提供了由该方法制备的生物海绵。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了一种胶原蛋白生物海绵的制备方法，其包括：(1)将含壳聚糖的酸性溶液加入到含胶原蛋白的酸性溶液中，混合均匀后，注入模具，低温冷冻成型；(2)对步骤(1)的冷冻成型产物进行冷冻干燥，获得初级生物海绵；(3)将步骤(2)获得的初级生物海绵浸泡入含原花青素的溶液中交联，然后用水洗涤；(4)对步骤(3)获得的洗涤产物进行冷冻干燥，获得胶原蛋白生物海绵；和，(5)任选对胶原蛋白生物海绵进行剪裁。在本文中，胶原蛋白优选为重组人源胶原蛋白。例如，本专利技术的重组人源胶原蛋白可以是中国专利200610098297.5所公开的方法获得的重组人源胶原蛋白，更优选的是，通过专利公开号CN102443057A提供的高密度发酵和纯化方法，利用通过不同重复数同向串联基因重组质粒所构建的巴氏毕赤酵母基因工程菌(菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.5021)而生产的重组人源胶原蛋白。人源胶原蛋白比起动物(尤其是非哺乳动物)胶原蛋白而言，对人体的使用安全性更为可靠，尽管机械强度会差一些。在本文中，低温是低于-10℃。通常利用液氮、干冰能够形成稳定的低温，当然市售的冰箱中有能够稳定维持-80℃的冰箱，也可以采用。所以，优选在本专利技术的第一方面的制备方法中，步骤(1)中的低温是-20～-195℃，优选是-20～-80℃，如-80℃。优选在本专利技术的第一方面的制备方法中，步骤(1)中混合均匀后的胶原蛋白和壳聚糖的质量比例为0.05～10:1，优选是0.1～9:1，更加优选是本专利技术实施例中机械强度高的所对应的质量比例。一些优选的实施例，在块状的情况下，已经相当于现有技术制备的密度更高的薄膜状的机械强度了。优选在本专利技术的第一方面的制备方法中，步骤(1)中的含壳聚糖的酸性溶液中壳聚糖的含量为0.05～7％(w/w)，优选为0.1～5％(w/w)，更加优选是本专利技术实施例中机械强度高的所对应的含量。壳聚糖可以通过市售渠道方便地获得。优选在本专利技术的第一方面的制备方法中，步骤(1)中的含胶原蛋白的酸性溶液中胶原蛋白的含量为0.05～7％(w/w)，优选为0.1～5％(w/w)，更加优选是本专利技术实施例中机械强度高的所对应的含量。本专利技术人研究发现，如果不添加乙醇，即使经过冷冻步骤，机械强度也会有约一个数量级的下降。所以，优选在本专利技术的第一方面的制备方法中，步骤(3)中的溶液含无水乙醇，其中无水乙醇的含量为5～60％(V/V)，优选为10～50％(V/V)，更加优选是本专利技术实施例中机械强度高的所对应的含量。在本文中，酸性溶液优选是乙酸溶液，如0.3～7％(w/w)乙酸溶液，优选是0.5～5％(w/w)乙酸溶液，更加优选是本专利技术实施例中机械强度高的所对应的乙酸溶液。优选在本专利技术的第一方面的制备方法中，步骤(3)中的溶液的pH值为5～9.5，优选为6～9，更加优选是本专利技术实施例中机械强度高的所对应的pH。在本文中，浸泡入含原花青素的溶液中是浸泡入过量含原花青素的溶液中，即浸泡前后溶液中原花青素的含量基本不变，如前后浓度仅仅下降不超过10％，或仅仅下降不超过5％。这通过较大的盛装溶液的容器并大量注入溶液即可实现。本专利技术人发现，原花青素浓度对于生物海绵的机械强度有一定影响。优选在本专利技术的第一方面的制备方法中，步骤(3)中的溶液的原花青素的含量为0.01～5％(w/w)，优选为0.05～4％(w/w)，更优选为0.08～3％(w/w)，最优选为0.1～2％(w/w)，如本专利技术实施例中机械强度高的所对应的含量。在本文中，洗涤是为了除去不反应物，如盐和酸碱。实践中，洗涤后的pH是洗涤的可操作指标，将生物海绵洗涤至pH中性或接近中性，可以表示洗涤的完成。优选在本专利技术的第一方面的制备方法中，步骤(3)中的洗涤是洗涤至pH6.5～7.5，优选是6.8～7.2。在本文中，本专利技术的生物海绵可以根据模具的形状进行定形。通过模具的大小和形状，可以根据实际需求制成任意形状和大小，如长方体、立方体、圆柱体、圆台形，等等。而现有技术制备的基本上是薄膜状(或者称“膜”)的，厚度一般不超过0.1cm，甚至能够透光。优选在本专利技术的第一方面的制备方法中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶原蛋白生物海绵的制备方法，其由如下步骤组成：(1)将含壳聚糖的酸性溶液加入到含胶原蛋白(优选为重组人源胶原蛋白)的酸性溶液中，混合均匀后，注入模具，低温冷冻成型；(2)对步骤(1)的冷冻成型产物进行冷冻干燥，获得初级生物海绵；(3)将步骤(2)获得的初级生物海绵浸泡入含原花青素的溶液中交联，然后用水洗涤；(4)对步骤(3)获得的洗涤产物进行冷冻干燥，获得胶原蛋白生物海绵，其中胶原蛋白生物海绵是不透光且块状的，其中所述块状的小于长和/或宽的高度大于0.1cm，优选不小于0.2cm，更不小于0.5cm，更加优选不小于1cm，如不小于2cm、3cm或5cm；和，(5)任选对胶原蛋白生物海绵进行剪裁。

【技术特征摘要】
1.胶原蛋白生物海绵，其由如下方法制备：将重组人源胶原蛋白溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成5％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成5％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含10％(v/v)无水乙醇的pH值为6磷酸盐缓冲液中，配制成0.5％(w/w)原花青素溶液；在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为0.1:1时，继续搅拌240分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵；然后，将初级生物海绵于25℃浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次，直至洗脱的水的pH达到6.8或以上，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。2.胶原蛋白生物海绵，其由如下方法制备：将重组人源胶原蛋白溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成4％(w/w)重组人源胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于3％(w/w)乙酸水溶液中，配制成4％(w/w)壳聚糖溶液；另外，将原花青素溶于含20％(v/v)无水乙醇的pH值为6磷酸盐缓冲液中，配制成2％(w/w)原花青素溶液；在冰浴条件下，将壳聚糖溶液滴入重组人源胶原蛋白溶液，期间搅拌，直至重组人源胶原蛋白与壳聚糖的质量比例为0.25:1时，继续搅拌180分钟，用真空脱泡机真空脱泡，然后将混合溶液注入模具中，在-80℃温度下冷冻成型，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成初级生物海绵；然后，将初级生物海绵于25℃浸泡于原花青素溶液中交联48小时，而后用去离子水浸泡，期间换水多次，直至洗脱的水的pH达到6.8或以上，再次置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白生物海绵。3.胶原蛋白生物海绵，其由如下方法制备：将重组人源胶原蛋白溶于2％(w...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨树林，张静，周爱梅，唐启伟，
申请(专利权)人：杨树林，
类型：发明
国别省市：江苏;32