高纯度胶原蛋白海绵的制备方法技术

高纯度胶原蛋白海绵的制备方法。它涉及胶原蛋白海绵的制备方法。它要解决现有方法制备的胶原蛋白海绵存在生产周期长、产率低、纯度低以及止血性能差的问题。方法：一、新鲜的牛跟腱预处理；二、胶原蛋白的提取；三、离心；四、盐析；五、溶解；六、梯度透析；七、预冻；八、冷冻干燥；九、灭菌。本发明专利技术制备所得最终产品表面光滑平整，海绵孔径分布均一，产品止血性能较好。产品纯度较高（氨基酸总量高达97.73%），止血效果明显，无异味，安全无毒，产率高，时间短，清液无杂质，缩短了生产周期；整个制备过程都是在室温以下进行的，保持了胶原蛋白的生物活性，提高了临床中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】。它涉及胶原蛋白海绵的制备方法。它要解决现有方法制备的胶原蛋白海绵存在生产周期长、产率低、纯度低以及止血性能差的问题。方法：一、新鲜的牛跟腱预处理；二、胶原蛋白的提取；三、离心；四、盐析；五、溶解；六、梯度透析；七、预冻；八、冷冻干燥；九、灭菌。本专利技术制备所得最终产品表面光滑平整，海绵孔径分布均一，产品止血性能较好。产品纯度较高（氨基酸总量高达97.73%），止血效果明显，无异味，安全无毒，产率高，时间短，清液无杂质，缩短了生产周期；整个制备过程都是在室温以下进行的，保持了胶原蛋白的生物活性，提高了临床中的应用。【专利说明】
本专利技术涉及胶原蛋白海绵的制备方法。
技术介绍
13父原蛋白是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的25%~30%,相当于体重的6%，存在于几乎所有组织中，是一种细胞外基质蛋白，以不溶纤维形式存在，具高度抗张能力，对动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋骨、软骨的形成十分重要，是结缔组织的重要物质，是决定结缔组织韧性的主要因素。胶原蛋白是一类结构上既有共同特点又有差异的蛋白质家族，目前已发现有27种不同类型的胶原，按照被发现的先后顺序分别称为I型胶原、II型胶原、III型胶原等，用大写的罗马数字来进行命名。胶原蛋白和其他蛋白一样也是由氨基酸组成的，但在其组成中甘氨酸几乎占到了 1/3，并且脯氨酸和羟脯氨酸是各类蛋白质中最闻的，正因为氣基酸的组成特点，股原蛋白在空间中以稳定的二螺旋结构存在。胶原蛋白具有诸多优异的生物学性质，如低免疫性:胶原分子结构中的重复性单元大，免疫原性非常低，对机体无排异反应，亲和性好，一般生物机体不会对其产生慢性的排斥现象。各种类型的胶原蛋白广泛分布于机体的所有组织中，不同类型的胶原因分布和含量不同在机体中具有不同的功能。I型胶原蛋白是动物体内含量最多的一类胶原，是脊椎动物结缔组织中最重要和最常见的的胶原类型。I型胶原蛋白目前在组织工程中大量使用，使得从动物组织中提取I型胶原蛋白成为了近年来研究的热点。虽然I型胶原蛋白能从动物的许多的组织中提取，但选取适当的组织材料是提取胶原蛋白的首要条件。目前已知动物的跟腱和骨骼的纤维几乎都是I型胶原蛋白，因此选择动物跟腱组织为原料提取并制得的胶原蛋白海绵是I型胶原蛋白为主的，可以减少高纯度胶原蛋白海绵制备过程中的提纯工艺。目前从动物组织中提取胶原蛋白一般有两种方法:使用溶剂的化学法和使用酶的生物化学法。选择提取胶原的`组织材料后要进行预处理，去掉上面的非胶原成分，特别是要用有机溶剂抽提出其中的脂肪组织。由于使用溶剂的化学法容易造成肽键的水解，得到的胶原蛋白相对分子质量较低，因此在制备胶原蛋白时通常是使用酶的生物化学法。该法常用于提取胶原蛋白的溶剂有中性盐和酸性溶剂:中性盐主要采用Tris-HCl，氯化钠、柠檬酸盐等，在中性条件下，胶原蛋白不能溶解在低浓度的盐溶液中，当盐的浓度达到一定量时，胶原就会发生溶解，中性盐做溶剂提取胶原蛋白工艺不稳定是其主要缺点；酸性溶剂多采用弱酸如醋酸、柠檬酸等溶液，主要通过低离子浓度及酸性条件破坏胶原蛋白分子间的盐键和Schiff键，引起胶原纤维膨胀、溶解，从而达到提取的目的。酸性溶剂提取胶原蛋白具有水解反应快，无污染，提取的胶原蛋白物理化学性质稳定等优点。一般是在酸性溶剂中，胃蛋白酶催化水解胶原的端肽非螺旋区，对螺旋区无作用，这样溶解的胶原具有完整的三螺旋结构，更降低了胶原蛋白的抗原性，适用于做生物医用材料。每种方法提取的胶原蛋白都有杂质，为了分离非胶原物质，在胶原粗提液中加入较多的粉状盐将全部胶原沉析出来，进行粗提纯，再将沉淀溶解在中性盐溶液中，进行透析，除去小分子的盐类杂质，从而得到纯度较高的胶原蛋白海绵。目前市场上已有几种胶原蛋白海绵应用于临床，做为组织工程材料和止血材料使用。该类胶原蛋白产品主要是采用酸性溶剂酶的生物化学法进行提取，最后经过盐析、透析工艺得到胶原蛋白海绵。通过对其产品进行微观孔形貌和氨基酸分析，电镜下能明显看到胶原蛋白产品上吸附一些没有除去的小分子盐类，而且氨基酸分析结果显示，该方法得到的胶原蛋白纯度较低。低纯度的胶原蛋白海绵，做为止血材料，具有一定止血功能，但作用时间较慢，不具有快速止血的效果。目前的工艺得不到高纯度的胶原蛋白海绵主要是由于在透析过程中，采用的是一步透析法，一步法透析过程中小分子盐类杂质不能完全去除干净，影响了最后得到的胶原蛋白海绵产品的纯度。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有方法制备的胶原蛋白海绵存在生产周期长、产率低、纯度低以及止血性能差的问题，而提供了。，按以下步骤进行:一、新鲜的牛跟腱预处理:将100~250g新鲜的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗净切成0.5cmX 0.5cm的小块放入组织捣碎机中,加入300~500ml蒸懼水,开机捣碎，然后用蒸馏水洗涤，再用1000ml质量浓度为0.05%~3%的碳酸钠溶液浸泡10~24h，过滤，将沉淀在自然状态下干燥；二、胶原蛋白的提取:将5~50g干燥后的牛跟腱置于三口烧瓶中，加入500~1500ml质量浓度为0.1%~5%的乙酸，搅拌使其溶解，然后加入100~500ml含有0.5~5g胃蛋白酶或者无花果蛋白酶的质量浓度为0.1%~5%的乙酸，再置于5°C的恒温水槽中均匀间歇搅拌并提取2~4天，获得提取液；`三、离心:将提取液进行冷冻离心，离心机温度为-5~5°C，转速为10000~15000转/分，离心20~30min，取离心的上层清液；四、盐析:将离心后的清液边搅拌边加入质量浓度为5%~15%的柠檬酸钠溶液调节pH值至6.5~8.0,搅拌均匀，然后加入NaCl粉末进行盐析，使NaCl的浓度为1.5~5mol/l，边加边搅拌，胶原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中静置12~24h，获得胶原混合液；五、溶解:将胶原混合液过滤，然后用蒸馏水清洗沉淀3~5次，再向过滤出的胶原沉淀中加入300~500ml的Tris-HCl缓冲溶液，边加边搅拌至胶原蛋白完全溶解，然后置于4°C冰箱中静置24~48h，获得溶解的胶原溶液；六、梯度透析:①将溶解的胶原溶液装入截留分子量为五万的透析袋中，在磁力搅拌下首先用质量浓度为1.5%~3%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；其次用质量浓度为0.3%~1.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；最后用质量浓度为0.08%~0.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h换一次透析外液；②将透析完的胶原溶液取出装入截留分子量为一万的透析袋中，在磁力搅拌下用蒸馏水做透析外液，每12h换一次蒸馏水，直至透析外液用硝酸银溶液检测没有沉淀产生为止，获得透析好的胶原溶液，整个透析过程都在室温下进行，透析外液的体积为内液的8~12倍；七、预冻:将透析好的胶原溶液注入不锈钢盘模具中，然后室温下静置脱泡5~IOh,再放入低温冰箱中采用程序降温，降温速度为10°C /h,从常温降温至-50°C~_80°C并预冻12~24h，获得预冻好的胶原溶液；八、冷冻干燥:将预冻好的胶原溶液放入冷冻真空干燥机中，真空干燥36~72h，获得冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵；九、灭菌:将冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵装入铝箔袋中，用封口机封口，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】
高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于它按以下步骤进行：一、新鲜的牛跟腱预处理：将100～250g新鲜的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗净切成0.5cm×0.5cm的小块放入组织捣碎机中，加入300～500ml蒸馏水，开机捣碎，然后用蒸馏水洗涤，再用1000ml质量浓度为0.05%～3%的碳酸钠溶液浸泡10～24h，过滤，将沉淀在自然状态下干燥；二、胶原蛋白的提取：将5～50g干燥后的牛跟腱置于三口烧瓶中，加入500～1500ml质量浓度为0.1%～5%的乙酸，搅拌使其溶解，然后加入100～500ml含有0.5～5g胃蛋白酶或者无花果蛋白酶的质量浓度为0.1%～5%的乙酸，再置于5℃的恒温水槽中均匀间歇搅拌并提取2～4天，获得提取液；三、离心：将提取液进行冷冻离心，离心机温度为‑5～5℃，转速为10000～15000转/分，离心20～30min，取离心的上层清液；四、盐析：将离心后的清液边搅拌边加入质量浓度为5%～15%的柠檬酸钠溶液调节pH值至6.5～8.0，搅拌均匀，然后加入NaCl粉末进行盐析，使NaCl的浓度为1.5～5mol/l，边加边搅拌，胶原蛋白完全析出后置于4℃冰箱中静置12～24h，获得胶原混合液；五、溶解：将胶原混合液过滤，然后用蒸馏水清洗沉淀3～5次，再向过滤出的胶原沉淀中加入300～500ml的Tris‑HCl缓冲溶液，边加边搅拌至胶原蛋白完全溶解，然后置于4℃冰箱中静置24～48h，获得溶解的胶原溶液；六、梯度透析：①将溶解的胶原溶液装入截留分子量为五万的透析袋中，在磁力搅拌下首先用质量浓度为1.5%～3%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；其次用质量浓度为0.3%～1.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；最后用质量浓度为0.08%～0.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h换一次透析外液；②将透析完的胶原溶液取出装入截留分子量为一万的透析袋中，在磁力搅拌下用蒸馏水做透析外液，每12h换一次蒸馏水，直至透析外液用硝酸银溶液检测没有沉淀产生为止，获得透析好的胶原溶液，整个透析过程都在室温下进行，透析外液的体积为内液的8～12倍；七、预冻：将透析好的胶原溶液注入不锈钢盘模具中，然后室温下静置脱泡5～10h，再放入低温冰箱中采用程序降温，降温速度为10℃/h，从常温降温至‑50℃～‑80℃并预冻12～24h，获得预冻好的胶原溶液；八、冷冻干燥：将预冻好的胶原溶液放入冷冻真空干燥机中，真空干燥36～72h，获得冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵；九、灭菌：将冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵装入铝箔袋中，用封口机封口，然后用60Co进行辐照灭菌，即完成高纯度胶原蛋白海绵的制备；其中步骤二中均匀间歇搅拌为每搅拌10h后停止0.5～1h。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄玉东，李大龙，贺金梅，程玮璐，吴亚东，王承旭，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23