一种新型类人胶原蛋白止血敷料制造技术

本发明专利技术公开了一种具有良好生物相容性的可吸收的富集钙、锌、铜、铁的新型的类人胶原蛋白止血敷料及其制备方法。该制备方法是利用高密度发酵制备的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铜、铁四种离子的改性蛋白为原料，利用哺乳动物体内存在的赖氨酰氧化酶为交联剂，通过低温交联反应和冷冻干燥工艺过程，获得了可用于创伤和术后止血的新型胶原蛋白止血敷料。本发明专利技术制备方法原料易得，成本低，合成工艺简单易实现，工艺放大容易且重现性好；本发明专利技术制备的类人胶原蛋白止血敷料无动物源病毒隐患，止血效果显著，可用作各类创面止血和术后止血，以及生物医学组织工程等相关领域的基础研究与应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新型富集钙、锌、铜、铁元素的类人胶原蛋白止血敷料及其制备方法。
技术介绍
胶原蛋白是动物体内的一种纤维蛋白，富含于皮肤、筋腱、骨骼中，具有良好的生物相容性，常被用作重要的生物医用材料原料，可作为吸收性创面止血材料，常利用胶原蛋白被交联后的多孔结构吸收血液膨胀，形成凝血的网架，封闭血管裂口或者创面，并激活血小板，达到止血的目的。目前，对于可吸收性胶原蛋白类创面止血材料，因胶原蛋白来源于动物皮、筋腱等，对人体而言属于一种异源物，可引起过敏等不良反应，表现为发热、嗜酸粒细胞增多、引起伤口的感染;止血速度较慢，对血小板等止血成分的牵拉能力和创面修复能力均不好。此外，异源型动物胶原蛋白还存在一些潜在的动物携带病原的风险。钙离子是人体内最重要的宏量元素之一，广泛分布于体内各组织器官之中，维系着所有细胞的正常生理功能。钙离子不仅参与了肌肉收缩、骨骼形成、神经传导，还有一个非常重要的作用就钙离子参与了血液凝固和能够促进创伤面的修复。凝血过程主要分为三个阶段:凝血酶原激活物的形成、凝血酶原的激活和纤维蛋白的形成。作为凝血因子IV的钙离子，参与了上述凝血过程的三个阶段。研究表明，钙离子能从血液中“捕获”并活化一种关键凝血蛋白质一凝血酶，必须在一定浓度的钙离子和纤维原蛋白存在时凝血过程才能很好地实现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种富集钙、锌、铜、铁元素，并且无潜在病毒隐患和良好的生物相容性以及优异的创面止血修复效果的类人胶原蛋白止血敷料。本专利技术另一目的是提供上述类人胶原蛋白止血敷料的制备方法。本专利技术的具体过程如下: 一种类人胶原蛋白止血敷料，其采取以下制备方法得到:在以基因工程菌高密度发酵的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铁、铜离子制备的螯合型重组类人胶原蛋白的水溶液中，加入交联剂赖氨酰氧化酶进行酶法交联、陈化、冷冻和超低温冷冻处理后，进行真空冷冻干燥，Co60照射灭菌，获得最终的可吸收性类人胶原蛋白止血敷料。所述螯合钙型、螯合锌型、螯合铁型、螯合铜型的重组类人胶原蛋白的质量比为:(500-600): (10-15): (10-20): (1-5)，总胶原蛋白溶液质量体积比浓度为5?20%。赖氨酰氧化酶质量体积比浓度为0.01-0.5%。交联反应温度为20?45°C，具体可为20°C、25°C、37°C或45°C等;反应时间为5?48h，具体可为5h、10h、24h或48h等。上述制备得到的类人胶原蛋白止血敷料的吸水率为3400%，凝血速率可达51 s。本专利技术所述的交联后样品需进行超低温冷冻和冷冻干燥处理，并通过Co60照射灭菌方可使用。本专利技术的优点: (1)本专利技术所涉及的胶原蛋白为基因工程菌高密度发酵的人源型胶原蛋白，具有优异的生物相容性、促细胞生长、无动物病毒隐患的特点，以这样蛋白改性的螯合钙、锌、铁、铜元素的胶原蛋白不仅同样保留了原胶原蛋白基质的优点，同时增加了离子辅助功效，大大提升了(术后)创伤面的高止血效果和促进创面愈合的功效； (2)本专利技术所涉及的交联剂是存在于哺乳动物中的铜依赖性氨基酸氧化酶，源于细胞分泌的赖氨酸氧化酶原在胞外被剪切加工而成的，能够催化细胞外基质蛋白(如胶原蛋白和弹性蛋白)中赖氨酸残基的ε_氨基氧化去氨基形成赖氨酸-乙醛，和相邻的分子的三螺旋区域(Hyl-Gly-His-Arg)中的一个高度保守的赖氨酰胺氧化酶结合位点上羟赖氨酸的反ε-氨基生成希夫碱(醛亚胺)，从而实现胶原蛋白和弹性蛋白的可溶性单体转变为稳定性较强的不溶性纤维。该交联剂的使用不仅仅是对胶原蛋白分子的作用，还能够合成细胞外基质，影响细胞增殖和细胞趋化，促进创伤面的组织再生，故其单体在交联后的残存无需去除； (3)本专利技术制备方法原料易得，成本低，合成工艺简单易实现，产品质量稳定，工艺放大容易且重现性能好。本专利技术所制备的新型止血敷料在医用生物材料与组织工程等相关领域有着良好的应用前景。【附图说明】图1为实施例1制备的新型止血敷料的样品图； 图2为实施例1制备的新型止血敷料的SEM图； 图3为实施例5中的新型止血敷料的细胞培养荧光图； 图4为实施例6中的新型止血敷料的止血效果图； 图5为实施例6中的新型止血敷料的止血4周后效果图。【具体实施方式】下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法;所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1富含钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的制备 按照质量比为100:2:2:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为10% (w/v)的胶原蛋白溶液100 ml;在搅拌下向上述蛋白溶液中加入0.05%(w/v)的交联剂赖氨酸氧化酶2mL，混匀后倒入模具，在25°C下保温24h，再转入超低温冰箱中冷冻2?4h;将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24?48h，取出封装，Co60照射灭菌，获得可降解人源型胶原蛋白止血敷料。制备的新型止血敷料的外观照片如图1所示，其微观结构的SEM图见图2所示，该止血敷料的吸水率约为3400%。实施例2富含钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的制备 按照质量比为100:3:4:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为5%(w/v)的胶原蛋白溶液200 ml;在搅拌下向上述蛋白溶液中加入质量分数为0.5%的交联剂赖氨酸氧化酶0.4ml，混匀后倒入模具，在20°C下保温48h，再转入超低温冰箱中冷冻2?4h;将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24?48h，取出封装，Co60照射灭菌，获得可降解人源型胶原蛋白止血敷料。实施例3富含钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的制备 按照质量比为400:10:10:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为15%(w/v)的胶原蛋白溶液200ml ；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入质量分数为0.05%(w/v)的交联剂赖氨酸氧化酶6mL，混勾后倒入模具，在45°C下保温5h，再转入超低温冰箱中冷冻2?4h;将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24?48h，取出封装，Co60照射灭菌，获得可降解人源型胶原蛋白止血敷料。实施例4富含钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的制备 按照质量比为100:2:4:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为20%(w/v)的胶原蛋白溶液10ml ；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入质量分数为0.01%的交联剂赖氨酸氧化酶1mL，混匀后倒入模具，在37°C下保温101!，再转入超低温冰箱中冷冻2?4h;将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24?48h，取出封装，Co60照射灭菌，获得可降解人源型胶原蛋白止血敷料。实施例5富集钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种类人胶原蛋白止血敷料，其特征在于采取以下制备方法得到：在以基因工程菌高密度发酵的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铁、铜离子制备的螯合型重组类人胶原蛋白的水溶液中，加入交联剂赖氨酰氧化酶进行酶法交联、陈化、冷冻和超低温冷冻处理后，进行真空冷冻干燥，Co60照射灭菌，获得最终的可吸收性类人胶原蛋白止血敷料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范代娣，米钰，郑晓燕，马沛，惠俊峰，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61