本发明专利技术公开了一种重组类人Ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法，它的全长为344个氨基酸，以人Ⅰ型胶原蛋白α1链660-964位肽段为基本构架，在其N端添加680-694位的15个氨基酸、在C端添加950-964位的15个氨基酸以及3组GER氨基酸三联体。本发明专利技术类人Ⅰ型胶原蛋白由毕赤酵母分泌表达，无需破碎细胞，经过凝胶过滤一步纯化，可以得到纯度>95％的重组蛋白。同时，利用纤维床生物反应器系统，固定化发酵重组工程菌。具有不需反复接种、细胞密度高、传质效率好、制作简单等优点，可以显著地提高重组类人Ⅰ型胶原蛋白的产量。该蛋白可以应用于化妆品行业，也可以应用于组织工程领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及重组人I型胶原蛋白在毕赤酵母中的表达、 固定化发酵以及生物活性鉴定。
技术介绍
胶原蛋白是一种非常关键的结构蛋白，主要存在于哺乳动物结缔组织的细胞外 基质中，占全身蛋白总量的25%~35%(1^11〇，附1?)〇]\1，13〇抑116 6七&1.(]〇11&8611已11(1 Gelatin. Annual Review of Food Science and Technology, 2015, 6:527-557) 〇 胶原蛋白 由三条α链相互缠绕形成的右手螺旋结构，α链是由G-X-Y氨基酸三联体的重复序列构 成，G是甘氨酸，X和Y通常是脯氨酸和羟脯氨酸（He L，Mu C，Shi J et al. Modification of collagen with a natural cross-linker,procyanidin. International journal of biological macromolecules，2011，48 (2) : 354-359) D 到目前为止，已发现 29 种 胶原蛋白，其中I型胶原蛋白含量最高，约占总量的90% (Jridi M，Bardaa S，Moalla D et al.Microstructure, rheological and wound healing properties of collagen-based gel from cuttlefish skin.International journal of biological macromolecules，2015, 77:369-374)。在新组织的形态发生和细胞代谢中，它赋予新组织机 械强度和特殊的生化特性（Ferreira AM，Gentile P，Chiono V，et al. Collagen for bone tissue regeneration. Actabiomaterialia，2012, 8 (9):3191-3200)〇 胶原蛋白具有生物可降解性、良好的生物相容性、低抗原性、低细胞毒性、亲水性 好等功能，并且能促进细胞增殖（Liu D，Nikoo M，Boran G et al. Collagen and Gelatin. Annual Review of Food Science and Technology，2015, 6:527-557) D 它能被加工形成各 种形式，例如交联的膜、薄片、珠粒、纤维和海绵（Lee C，Lee Y. Biomedical applications and tissue engineering of collagen. Advanced Drug Delivery, 2013:445) 〇 基于以上 特性，胶原蛋白被广泛地应用于临床医学，例如注射型胶原蛋白可以用于止血、烧伤、绷带、 血管移植等（Prajapati VD，Jani GK，Kapadia JR. Current knowledge on biodegradable microspheres in drug delivery. Expert opinion on drug delivery, 2015, 17:1-17)〇 胶原蛋白目前主要通过酸、碱水解的方式从动物结缔组织中提取，在提取过程中 无法避免会丧失部分生物活性，作用于人体会产生异种排斥反应，而且存在感染病毒的 隐患（Olsen Dj Jiang J，Chang R et al. Expression and characterization of a low molecular weight recombinant human gelatin:development of a substitute for animal-derived gelatin with superior features. Protein expression and purific ation，2005, 40(2) :346-357)。由于胶原蛋白在医用材料等领域有广阔的应用前景，所以 迫切需要新的手段制备胶原蛋白，利用基因工程技术生产重组人胶原蛋白成为热门的研 究令页域（Olsen Dj Yang C，Bodo M，et al. Recombinant collagen and gelatin for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews，2003, 55 (12) : 1547-1567) a Li 等将人 I 型 胶原蛋白α I链的氨基酸序列进行拼接和重复，经毕赤酵母表达和纯化，证明其能促进乳 仓鼠肾细胞的增殖（Li L, Fan D, Ma X，et al. High-level secretory expression and purification of unhydroxylated human collagen a I (III)chain in Pichiapastoris GSl15.Biotechnology and applied biochemistry, 2015,doi:10. 1002/bab. 1297)〇 Yao等重复构建类人I型胶原蛋白a I链的特定肽段，在大肠杆菌中表达、纯化，证明 该序列可以促进小鼠成纤维细胞3T3粘附和自身交联（Yao J, Yanagisawa S, Asakura T. Design, expression and characterization of collagen-like proteins based on the cell adhesive and crosslinking sequences derived from native collagens. Journal of biochemistry, 2004, 136(5):643-649)〇 纤维床生物反应器（fibrous bed bioreactor，简称FBB)，是一种以丝网为支 持物填装纤维材料作为固定化载体的反应器。与传统的固定化反应器相比，FBB采用具 有高孔隙率和高比表面积的纤维材料作为载体，传质效率高；FBB固定化的细胞可以不 断更新，活细胞比例高；同时FBB还有具有成本低、制作简单、底物耐受性高、稳定性好等 优点(Zhu H, Yang S T. Long-term continuous production of monoclonal antibody by hybridoma cells immobilized in a fibrous-bed bioreactor. Cytotechnolo gy, 2004, 44(1-2) : 1-14) 〇
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以毕赤酵母为表达体系的重组类人I型胶原蛋白制 备方法。毕赤酵母分泌表达生产的重组类人I型胶原蛋白既避免了动物来源胶原蛋白带来 的病毒隐患，又能够降低人体的免疫排斥反应，并明显地促进哺乳动物细胞的增值。本专利技术 同时利用纤维床生物反应器系统，固定化发酵重组工程菌，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组类人Ⅰ型胶原蛋白，其特征在于，它的全长为344个氨基酸，以人Ⅰ型胶原蛋白α1链660‑964位肽段为基本构架，在其N端添加680‑694位的15个氨基酸、在C端添加950‑964位的15个氨基酸以及3组GER氨基酸三联体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王菊芳，马毅，杨晶，李杉，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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