一种直接定量检测循环miRNA的RT‑qPCR方法技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接检测血清或血浆中循环microRNA(miRNA)的实时荧光定量RT‑qPCR方法。所述方法包括：S1：裂解血清或血浆中的外泌体及miRNA蛋白复合体，离心后得到循环miRNA粗提物；S2：miRNA加尾及逆转录；S3：RT‑qPCR定量检测。本发明专利技术miRNA直接荧光定量RT‑qPCR扩增方法[Direct S‑Poly(T)Plus,简称DSPP]中，不需要提取核酸，且miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体系中同步完成，操作简便，缩短时间，可在95分钟内完成cDNA的制备。该技术体系灵敏度与stem‑loop方法相比提高数十甚至上百倍，建立了一种非常简便、灵敏、高效、快捷、廉价的miRNA检测的技术体系。该技术体系尤其适合于临床应用推广及其从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。

RT qPCR method for direct quantitative detection of circulating miRNA

The present invention relates to the field of biomedicine, specifically relates to a nucleic acid extraction, direct detection of circulating microRNA in serum or plasma (miRNA) by real-time fluorescent quantitative RT qPCR method. The method comprises the following steps: S1: exosomes and cleavage of miRNA protein complexes in serum or plasma, obtained after centrifugation of circulating miRNA crude extract; S2:miRNA tailing and S3:RT reverse transcriptase; quantitative detection of qPCR. The invention of miRNA direct fluorescence quantitative RT qPCR amplification for [Direct (T) S Poly Plus, referred to as DSPP], does not need to extract the nucleic acid, and miRNA Poly (A) tail and reverse will be completed simultaneously, in a reaction system has the advantages of simple operation, shorten the time, to be completed in the preparation of cDNA 95 minutes. The system sensitivity and stem loop method to improve compared dozens or even hundreds of times, establish the technical system of a very simple, sensitive, efficient, fast and cheap miRNA detection. The system is especially suitable for clinical application and detection of miRNA from biological fluid samples with low miRNA abundance.

【技术实现步骤摘要】
一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、线虫等真核生物中。miRNA通过与靶mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)结合，降解靶mRNA或者阻止其翻译，从而在转录后水平上调控基因的表达。功能上，miRNA广泛参与细胞的分化、增殖、凋亡、个体生长发育以及器官形成。生物体内miRNA表达被精细调控，具有严格的时空特异性。研究发现，血液中存在着循环miRNA且非常稳定，更为重要是，循环miRNA的异常与许多疾病的发生发展密切相关，可作为癌症等重大疾病早期诊断和预后评估的新型生物标记物。长期以来，基于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测技术一直都被认为是最灵敏的miRNA检测手段之一，比较常用的有poly(A)加尾法(ShiR,Biotechnique.2005,39(4):519-525)和茎环引物(Stemloop)法(ChenC,NucleicAcidsRes.2005,33(20):1-9)。Poly(A)加尾法是利用poly(A)聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly(A)尾巴，然后用含有Oligo(dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录引物的通用性，因此Poly(A)加尾法在降低检测成本的同时，也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法中逆转录引物5’端含有一个茎环结构，3’端通常具有6个与miRNA3’端配对的特异性碱基，可以特异性的进行逆转录反应。但是由于茎环引物法使用的是序列特异性探针，在高通量的miRNA分析中成本相对昂贵，此外，依赖于6个匹配碱基在结合力度方面显然是不够的，会显著降低cDNA合成的效率。KangK等专利技术了一种新型的检测miRNA的方法S-Poly(T)法，分别在其专利申请CN102154505A(在该专利中称为S-S-Oligo(dT)法，所用引物称为S-S-Oligo(dT)引物)和文章(Kang,K,PloSone.2012.7,e48536.)中进行了公开。在S-Poly(T)方法中，所用引物从5’端开始依次是14-20个碱基的PCR通用引物序列，14-20个碱基的通用探针序列，8-30个dT及与目的miRNA分子的3’端3-8个核苷酸互补配对的特异性序列。与poly(A)加尾法和茎环引物法相比，S-Poly(T)方法的特异性和灵敏度都大大提高，灵敏度至少提高10倍以上。在升级版的S-Poly(T)Plus方法中(专利申请号：201510558101.5)，miRNA的Poly(A)加尾和逆转录一步反应完成，因此在操作简便性和逆转录效率方面，S-Poly(T)Plus技术又有进一步改进和提高，其总体灵敏度比S-Poly(T)方法提高2-8倍。现有miRNA检测方法都是基于纯化的RNA为模板，由于提取核酸中RNA沉淀和回收的不完全，将会不可避免的造成一些RNA丢失。此外，RNA提取过程费时，易造成污染和降解。可见，现有技术还有待完善。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种不需提取核酸，更为简便、灵敏、高效、廉价的直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，称之为DirectS-Poly(T)Plus(DSPP)。为了实现上述专利技术目的，本专利技术包含以下技术方案：一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，所述方法不需提纯核酸，将miRNA从蛋白复合体中裂解出来，直接进行RT-qPCR检测。进一步的，所述直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，包含以下步骤：S1、裂解离心：利用裂解用试剂将样本中的蛋白复合体中充分裂解，使miRNA从样本中的蛋白复合体中释放出来；将所得的混合物离心，得上清即为粗提RNA，40ul的混合物可以吸取约35ul上清；S2、加尾逆转录：将所述步骤S1中所获得粗提RNA进行加Poly(A)尾及S-Poly(T)特异性逆转录；S3、RT-qPCR定量检测：以步骤S2中获得的逆转录产物cDNA为模板进行RT-qPCR定量检测。进一步的，所述步骤S1中所述样本用量为20～50ul。进一步的，所述步骤S1中裂解用试剂包括组分：20ul2×lysisbuffer、1ul蛋白酶K，所述裂解用试剂对应处理20ul样本。进一步的，所述2×lysisbuffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、300mmol/lNaCl、20mmol/lMgCl2；pH为8.0。进一步的，所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。进一步的，所述裂解条件为50℃处理20分钟，然后95℃保持5分钟。进一步的，所述步骤S1中的离心条件为：10，000～14，000g，4℃条件下离心5～15分钟；优选13,000g，4℃条件下离心5分钟。进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录的反应体系包含多聚腺苷酸聚合酶(polyApolymerase)和逆转录酶(reversetranscriptase)。进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录反应体系中所加入粗提RNA模板的体积百分比为5～75％，优选40％。进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含：0.5-7.5uL上清模板、1±0.2μL的0.5μmol/LRTprimer、1±0.2U的PolyAPolymerase、100±20U的MMLV、2.375-0.625uL的reactionbuffer、RNase-freeWater补足至10μL；加尾逆转录的反应条件为：37～42℃保温50～70min，74～76℃保温3～7min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含：4uL上清模板，1μL的0.5μMRTprimer，1U的PolyAPolymerase，100U的MMLV，1.5μL的reactionbuffer，RNase-freeWater补足至10μL；加尾逆转录的反应条件为：37℃保温30min，42℃保温30min，75℃保温5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。进一步的，所述步骤S3中以cDNA为模板进行real-timePCR定量检测，此过程使用的DNA聚合酶为热启动酶，目的是减少非特异性扩增；real-timePCR反应体系为：4×qPCRreactionBuffer：5μL、1μmol/LForwardPrimer4μL、10μmol/Luniversalreverseprimer0.4μL、10μmol/LuniversalTaqmanprobe0.5μL、100×ROXRerferenceDye0.2μL、hotstartAlphaTaqPolymerase0.0125μL、cDNA0.5μL、RNase-freeWater加至20μL；反应条件为：预变性95℃5分钟，变性95℃10s，退火60℃40s，40个循环。进一步的，所述热启动酶的制备方法为：将DNA聚合酶和热启动抗体等体积混合，室温放置6小时。进一步的，所述样本包括血清、血浆/血清、尿液、眼泪、乳汁、唾液、痰液或粪便抽提上清；优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种直接定量检测循环miRNA的RT‑qPCR方法，其特征在于，所述方法，包含以下步骤：S1、裂解离心：利用裂解用试剂将样本中的蛋白复合体中充分裂解，使miRNA从样本中释放出来；短暂离心后，所得上清液即为粗提RNA；S2、加尾逆转录：将所述步骤S1中所获得的粗提RNA进行加Poly(A)尾及S‑Poly(T)特异性逆转录；S3、RT‑qPCR定量检测：以步骤S2中获得的逆转录产物cDNA为模板进行RT‑qPCR定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，其特征在于，所述方法，包含以下步骤：S1、裂解离心：利用裂解用试剂将样本中的蛋白复合体中充分裂解，使miRNA从样本中释放出来；短暂离心后，所得上清液即为粗提RNA；S2、加尾逆转录：将所述步骤S1中所获得的粗提RNA进行加Poly(A)尾及S-Poly(T)特异性逆转录；S3、RT-qPCR定量检测：以步骤S2中获得的逆转录产物cDNA为模板进行RT-qPCR定量检测。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中裂解用试剂包括组分：20ul2×lysisbuffer、1ul蛋白酶K，所述裂解用试剂对应处理20ul样本。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述2×lysisbuffer包含以下终浓度的组分：100mMTris-HCl、300mMNaCl、20mMMgCl2；pH为8.0。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中裂解用试剂的反应条件为50℃处理20分钟，然后95℃保持5分钟。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中的离心条件为：10，000～14，000g，4℃条件下离心5～15分钟。7.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤S2中加尾逆转录反应体系中所加入粗提RNA模板的体积百分比...

【专利技术属性】
技术研发人员：苟德明，牛燕琴，康康，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44