一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术和应用领域，具体涉及一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法及其应用。所述方法其特征在于包括采用RNase III进行待测RNA打断、采用RNA连接酶连接接头、采用反转录酶和高保真DNA聚合酶体系进行一步法反转录和加标签PCR构建高通量测序文库的方法，本发明专利技术方法可应用于RNA高通量测序文库构建。本发明专利技术方法直接采用RNA进行单链加接头，省去随机引物扩增步骤，可以消除随机引物的影响，得到更全面的RNA信息，采用一步法进行反转录和加标签PCR，减少了中间步骤，有效提高了RNA文库的制备效率和测序质量。

An optimized method for constructing high-throughput sequencing Library of RNA and its application

The invention belongs to the molecular biology technology and the application field, in particular relates to an optimized RNA high-throughput sequencing library construction method and its application. The method is characterized in that it comprises using RNase III method detected RNA by RNA ligase, interrupted by joint, reverse transcriptase and high fidelity DNA polymerase system of one-step reverse transcription and labelling PCR high-throughput sequencing library construction, the method of the invention can be used to construct RNA high-throughput sequencing library. The method directly using RNA single joint, eliminating random amplified steps, can eliminate the influence of random primers, more comprehensive information on the RNA, reverse transcription and labeling of PCR by one-step method, reduce intermediate steps, improve the efficiency and quality of the preparation of RNA library sequencing.

【技术实现步骤摘要】
一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法及其应用。
技术介绍
以Illumina测序平台为代表的下一代测序（Next-generationSequencing，NGS）目前已经在DNA测序领域、RNA测序领域等具有广泛的应用。RNA-seq可以把mRNA、小RNA、非编码RNA、RNA病毒等的RNA序列利用高通量测序技术一次实验测序获得。通常构建RNA测序文库一般包括以下步骤：将RNA片段采用机械法或酶法打断到一定长度、纯化打断的RNA、利用随机引物进行反转录、合成cDNA二链、末端修复和加A加接头、纯化、indexPCR扩增和indexPCR产物纯化。这样的建库方法包括三次繁琐的纯化步骤，对实验试剂、耗材、时间和人力造成了很大的浪费。同时，建库过程中需要采用随机引物，随机引物有时会带来反转录的不平衡，给测序结果带来一定偏差。为了消除RNA测序文库过程中存在的随机引物影响，减少纯化步骤，本专利技术提出了采用片段化的RNA直接连接接头，避免了随机引物的使用；将纯化步骤由三步减少到两步纯化，大量节约了人力物力，同时提高了RNA文库构建的质量和效率。
技术实现思路
第一方面本专利技术提供了一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法及其应用，所述的方法进行RNA高通量文库构建消除了RNA测序文库过程中存在的随机引物影响，减少了纯化步骤，大量节约了人力物力，同时提高了RNA文库构建的质量和效率。为解决上述技术问题，本专利技术的具体实施方式提供了一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法，本方法采用以下技术方案。本专利技术提供一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法，所述方法采用RNaseIII进行待测RNA样本打断、采用RNA连接酶连接接头、采用反转录酶和热启动高保真DNA聚合酶体系进行一步法反转录和加标签PCR构建高通量测序文库。本专利技术所述的待测RNA样本可以为mRNA样本、rRNA样本、单链病毒RNA样本、lncRNA样本等各种类型的用于高通量测序文库构建的RNA样本。本专利技术采用RNaseIII对所述待测序RNA样本进行打断，打断后的RNA片段带有突出的5’端磷酸基团和3’端羟基基团，无需经过其他处理，纯化后即可直接用于接头连接。本专利技术采用AgencourtRNACleanXPBeads（BeckmanCoulter公司产品）对打断后的RNA片段进行纯化，可以对打断后的RNA片段进行高效回收纯化。本专利技术采用T4RNA连接酶I对纯化后的mRNA片段进行加接头反应，T4RNA连接酶I可以高效的连接单链RNA接头的3’末端羟基基团和纯化后的mRNA片段5’末端磷酸基团，同时，T4RNA连接酶I可以高效的连接单链DNA接头的5’末端磷酸基团和纯化后的mRNA片段的3’末端羟基基团。连接反应后，纯化后的mRNA片段5’端连入人工合成的单链RNA接头，3’端连入人工合成的单链DNA接头。本专利技术提供的单链RNA接头和单链DNA接头序列为但不局限于Illumina测序平台通用接头序列，Illumina测序平台接头序列如下面NO.1和NO.2所示：NO.1:5’-ACACUCUUUCCCUACACGACGCUCUUCCGAUCU-3’NO.2:5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’。本专利技术采用一步法反转录和cDNAindexPCR，所述反转录反应采用多点突变改造的反转录酶Thermo-scriptRTase进行反转录，具有更好的延伸能力和稳定性；所述cDNAindexPCR反应采用热启动高保真DNA聚合酶进行cDNAindexPCR，具有更好的保真性，反应产物纯化可以直接用于Illumina测序平台进行测序。本专利技术采用SPRISelect磁珠（BeckmanCoulter公司产品）对indexPCR产物进行片段筛选和纯化，SPRISelect磁珠可根据实验需要纯化目的大小的DNA片段，用于后续测序反应。第二方面，本专利技术提供一种优化的RNA高通量测序文库构建的试剂盒，所述试剂盒第一方面所述的RNaseIII及其缓冲液、T4RNA连接酶I及其反应缓冲液、单链DNA和单链RNA接头、反转录酶Thermo-scriptRTase、热启动高保真DNA聚合酶及其反应缓冲液和indexPCR引物。第三方面，本专利技术提供如第一方面所述的方法，或第二方面所述的优化的RNA高通量测序文库构建的试剂盒，或第二方面所述的试剂盒在RNA高通量测序文库制备中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术采用对打断后的RNA片段直接加接头，避免了在RNA测序文库构建过程中使用随机引物，避免了随机引物引起的扩增不平衡的影响，提高了测序文库构建的质量；（2）本专利技术提供的RNA高通量测序文库构建的方法将纯化步骤由三步减少到两步纯化，大量节约了纯化试剂、纯化时间，节约了人工成本；（3）本专利技术提供的RNA高通量测序文库除可用于转录组文库构建、小RNA文库构建、lncRNA文库构建等外，还可以用于RNA病毒基因组文库构建；（4）本专利技术提供的RNA高通量测序文库用于构建RNA病毒基因组文库，可以得到更全面的RNA病毒基因组信息，更全面了解RNA病毒基因组遗传新消息；（5）本专利技术提供的RNA高通量测序文库可用于所有基于Illumina测序平台的RNA文库构建，更换接头和标签序列后还可用于其他测序平台如IonTorrent测序平台。附图说明图1本方法构建的拟南芥mRNA高通量测序文库用Agilent2100质检的结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。以下实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。1拟南芥叶片总RNA的提取和mRNA的纯化1）拟南芥叶片总RNA的提取采用Trizol法，具体步骤参见《分子克隆》第三版；2）拟南芥叶片mRNA的纯化采用TOYOBO公司mRNAPurificationKit纯化mRNA，具体步骤参见产品说明书。2拟南芥mRNA片段化1）取3-7μL拟南芥叶片mRNA（总含量100-500ng）置于一个新的RNasefree的0.2mLEP管，加入2μL5XRNaseIIIreactionbuffer和1μLRNaseIII，加RNasefree的ddH2O至总体积10μL；2）将步骤1）获得的混合物轻柔混匀后瞬时离心使液体存在于管底，37°C孵育10min。3片段化mRNA的纯化1）向反应结束后的步骤2）的EP管迅速加入40μLddH2O和110μLAgencourtRNACleanXPBeads（BeckmanCoulter公司产品）；2）吹打混匀后，瞬时离心后室温孵育15min；3）将步骤2）的EP管置于磁力架，静置5min；4）弃上清，加入150μL80%乙醇，室温孵育1min；5）将步骤4）的EP管置于磁力架，静置5min；6）重复步骤4），5）；7）弃上清，室温放置10min，晾干磁珠；8）磁珠重悬于15μLRNasefree的ddH2O，混匀后瞬时离心，置于磁力架上静置5min；9）转移上清至另一干净的RNasefree的的离心管。4片段化的mRNA加接头加接头本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法，其特征在于采用RNase III进行待测RNA样本打断、采用RNA连接酶连接接头、采用反转录酶和热启动高保真DNA聚合酶体系进行一步法反转录和加标签PCR构建高通量测序文库。

【技术特征摘要】
1.一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法，其特征在于采用RNaseIII进行待测RNA样本打断、采用RNA连接酶连接接头、采用反转录酶和热启动高保真DNA聚合酶体系进行一步法反转录和加标签PCR构建高通量测序文库。2.一种快速进行RNA单分子测序文库构建的方法其特征在于，所述方法包括如下步骤：1）待测序的RNA样本片段化；2）片段化mRNA的纯化；3）片段化的mRNA加接头；4）一步法反转录和cDNAindexPCR；5）PCR产物片段大小筛选和纯化。3.根据权利要求1和权利要求2所述的待测序RNA样本，其特征在于所述RNA样本可以为mRNA样本、rRNA样本、单链病毒RNA样本、lncRNA样本等各种类型的用于高通量测序文库构建的RNA样本。4.根据权利要求2所述的待测序RNA样本片段化，其特征在于采用RNaseIII对所述待测序RNA样本进行打断，打断后产生突出的5’端磷酸基团和3’端羟基基团。5.根据权利要求2所述的片段化mRNA加接头，其特征在于采用T4RNA连接酶I对所述片段化的mRNA进行加接头反应。6.根据权利要求1、2、5所述接头，其特征在于所述接头包括一条单链RNA接头和一条单链DNA接头；单链RNA接头和单链DNA接头序列可以但不...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴熙祥，孙孝政，
申请(专利权)人：哈尔滨博泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23