本发明专利技术公开了一种分子信标探针及含有该分子信标探针的试剂盒，所述分子信标探针包括Probe K34、Probe K35、Probe K38和Probe K183四种探针，它们的碱基序列分别为：Probe K34：5'‑CCCTACCCTAGTTGGAGCThGTGGCGTAGGCA GGGTAGGG‑3'；Probe K35：5'‑CCCTACCCTAGTTGG AGCTGhTGGCGTAGGCAGGGTAGGG‑3'；Probe K38:5'‑CCCTACCCTTGGAGCTGGTGaCGTAGGCAAGAGG GTAGGG‑3'；ProbeK183:5'‑CCCTACCCACAGC AGGTCAcGAGGAGTACAGTGGGTAGGG‑3'；每种探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。本发明专利技术分子信标探针和试剂盒能够对KRAS基因突变进行检测，且检测灵敏度高、检测准确度高。
A molecular beacon probe and kit for detection of KRAS gene mutation
Kit of the invention discloses a molecular beacon probe and containing the molecular beacon probe, the molecular beacon probe including four Probe K34, Probe probe K35, Probe K38 and Probe K183, nucleotide sequences of them were: Probe K34:5'CCCTACCCTAGTTGGAGCThGTGGCGTAGGCA GGGTAGGG 3'; Probe K35:5'CCCTACCCTAGTTGG AGCTGhTGGCGTAGGCAGGGTAGGG 3' Probe K38:5'; CCCTACCCTTGGAGCTGGTGaCGTAGGCAAGAGG GTAGGG 3' ProbeK183:5'CCCTACCCACAGC AGGTCAcGAGGAGTACAGTGGGTAGGG; 3'; each probe 5'end labeled with a fluorophore and quencher labeled with 3'. The molecular beacon probe and kit of the present invention can detect the mutation of KRAS gene, and have high sensitivity and high accuracy.
【技术实现步骤摘要】
一种检测KRAS基因突变的分子信标探针及试剂盒
本专利技术涉及检测KRAS基因突变的分子生物学领域，具体涉及一种检测KRAS基因突变的分子信标探针及试剂盒。
技术介绍
KRAS基因是癌基因，KRAS基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子(第12、13、61密码子)上，占所有突变的90％以上。KRAS基因突变可以导致细胞逃逸凋亡，这种在胰腺癌、大肠癌、肺癌中的发生率较高。在胰腺癌中。KRAS基因点突变发生率高达90％以上。KRAS基因突变检测对肿瘤早期诊断、肿瘤个体化治疗等具有重要意义。目前，KRAS基因突变的检测方法主要有基因测序法，和以荧光定量PCR为基础的检测方法。基因测序法检测灵敏度不够高，以荧光定量PCR为基础的检测方法精确度不够高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种检测KRAS基因突变的分子信标探针及试剂盒，本专利技术的分子信标探针能够通过杂交反应，借助荧光显微镜直接观察杂交体的荧光信号，以判断细胞内是否存在KRAS基因的突变体。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种分子信标探针，所述分子信标探针包括ProbeK34、ProbeK35、ProbeK38和ProbeK183四种探针，它们的碱基序列分别为：ProbeK34：5'-CCCTACCCTAGTTGGAGCThGTGGCGTAGGCAGGGTAGGG-3'；ProbeK35：5'-CCCTACCCTAGTTGGAGCTGhTGGCGTAGGCAGGGTAGGG-3'；ProbeK38：5'-CCCTACCCTTGGAGCTGGTGaCGTAGGCAAGAGGGTAGGG-3'；ProbeK183：5'-CCCTACCCACAGCAGGTCAcGAGGAGTACAGTGGGTAGGG-3'；每种探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。优选的，所述荧光基团选自：6-FAM、Fluorescein、JOE、TET、HEX、Cyanine3、ROX、TexasRed、Cyanine5或Cyanine5.5，所述淬灭基团选自：BHQ-1、BHQ-2、BHQ-2或DABCYL。进一步优选的，当5'端标记为6-FAM(或FAM)，3'端标记有BHQ-1或DABCYL时，荧光基团的激发波长为494nm，发射波长为515nm。当5'端标记为Fluorescein，3'端标记有BHQ-1或DABCYL时，荧光基团的激发波长为495nm，发射波长为520nm。当5'端标记为JOE，3'端标记有BHQ-1或DABCYL时，荧光基团的激发波长为520nm，发射波长为548nm。当5'端标记为TET，3'端标记有BHQ-1或DABCYL时，荧光基团的激发波长为521nm，发射波长为536nm。当5'端标记为HEX，3'端标记有BHQ-1或DABCYL时，荧光基团的激发波长为535nm，发射波长为555nm。当5'端标记为Cyanine3，3'端标记有BHQ-2或DABCYL时，荧光基团的激发波长为550nm，发射波长为570nm。当5'端标记为ROX，3'端标记有BHQ-2或DABCYL时，荧光基团的激发波长为573nm，发射波长为602nm。当5'端标记为TexasRed，3'端标记有BHQ-2或DABCYL时，荧光基团的激发波长为583nm，发射波长为603nm。当5'端标记为Cyanine5，3'端标记有BHQ-3或DABCYL时，荧光基团的激发波长为751nm，发射波长为674nm。当5'端标记为Cyanine5.5，3'端标记有BHQ-3或DABCYL时，荧光基团的激发波长为675nm，发射波长为694nm。本专利技术还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括上述至少一种分子信标探针。优选的，上述试剂盒还包括杂交液，每100ml所述杂交液包括以下组分：25mL的50*denhardtt's液，10mL的50*SSC，5mL的50*SSC，100ug/mL的变性鲑精DNA，10g的硫酸葡聚糖。用上述杂交液对分子信标探针进行稀释时，优选的，所述分子信标探针的浓度为5pmol/ul。使用上述分子信标探针或/和试剂盒进行KRAS基因突变检测的方法为：(1)根据KRAS基因各种突变体序列人工设计并合成分子信标探针；上述四种分子信标探针所对应的KRAS基因突变体的碱基序列分别为：34G>T/A/CATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT[G>T/A/C]GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATT35G>T/A/CATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG[G>T/A/C]TGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATT38G>AATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTG[G>A]CGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATT183A>CTTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTC[A>C]AGAGGAGTACAGTGCAATGAGGGACCAGTACATGAGGACTGGGG(2)以上述杂交液稀释探针至特定浓度，(3)准备肿瘤组织冰冻切片，厚度3-8μm；(4)肿瘤组织冰冻切片铺展与玻片(5)以10％福尔马林(即1份甲醛溶液加9份水配制而成)固定液固定组织于玻片。(6)将经95℃热变性的分子信标探针滴加在玻片上肿瘤组织的位置，加盖玻片并封闭，然后在42℃下孵育15分钟；(7)在荧光显微镜下观察结果。本专利技术所达到的有益效果：本专利技术分子信标探针和试剂盒能够对KRAS基因突变进行检测，且检测灵敏度高、检测准确度高。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。以下实施例所用DNA杂交液中，每100ml所述DNA杂交液包括以下组分：25mL的50*denhardtt's液，10mL的50*SSC，5mL的50*SSC，100ug/mL的变性鲑精DNA，10g的硫酸葡聚糖。实施例1先根据KRAS基因突变体的碱基序列(34G>T/A/C)设计合成分子信标探针ProbeK34，该探针的碱基序列为：5'FAM-CCCTACCCTAGTTGGAGCThGTGGCGTAGGCAGGGTAGGG-BHQ13'。该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中5'端标记的是FAM，3'端标记的是BHQ1，荧光基团的激发波长为494nm，发射波长为515nm。根据KRAS基因突变体的碱基序列(34G>T/A/C)设计合成荧光标记寡核苷酸探针ProbeK34c：5'-FAM-TAGTTGGAGCThGTGGCGTAGGCA-3'；普通荧光标记寡核苷酸探针实验步骤:(1)将置于玻片上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针包括Probe K34、Probe K35、Probe K38和Probe K183四种探针，它们的碱基序列分别为：Probe K34：5'‑CCCTACCCTAGTTGGAGCThGTGGCGTAGGCAGGGTAGGG‑3'；Probe K35：5'‑CCCTACCCTAGTTGGAGCTGhTGGCGTAGGCAGGGTAGGG‑3'；Probe K38：5'‑CCCTACCCTTGGAGCTGGTGaCGTAGGCAAGAGGGTAGGG‑3'；Probe K183：5'‑CCCTACCCACAGCAGGTCAcGAGGAGTACAGTGGGTAGGG‑3'；每种探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。
【技术特征摘要】
1.一种分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针包括ProbeK34、ProbeK35、ProbeK38和ProbeK183四种探针，它们的碱基序列分别为：ProbeK34：5'-CCCTACCCTAGTTGGAGCThGTGGCGTAGGCAGGGTAGGG-3'；ProbeK35：5'-CCCTACCCTAGTTGGAGCTGhTGGCGTAGGCAGGGTAGGG-3'；ProbeK38：5'-CCCTACCCTTGGAGCTGGTGaCGTAGGCAAGAGGGTAGGG-3'；ProbeK183：5'-CCCTACCCACAGCAGGTCAcGAGGAGTACAGTGGGTAGGG-3'；每种探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。2.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙喜元，王季武，
申请(专利权)人：苏州承美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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