本发明专利技术公开了一种靶向脑胶质瘤的磁性荧光双模态探针及其制备方法，利用纳米颗粒表面修饰的大量巯基和羧基，可以先利用DTDP活化巯基，再用巯基乙胺进行氨基化，接着连接羧基型荧光素，最后再把RGD键合到纳米颗粒表面对的羧基上。或者，直接在EDC/NHS活化纳米颗粒表面的羧基后，把RGD和氨基类荧光素直接连接在纳米颗粒表面。这两种方法都可以得到靶向性MRI/荧光双模态探针材料。本发明专利技术制备得到的分子影像探针在细胞水平和动物水平实现了MR/荧光双模态成像，并且由于RGD的介导。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于双模态分子影像探针的制备领域，特别涉及一种具有核磁/光学双模态成像功能的脑胶质瘤特异性分子影像探针的制备方法。
技术介绍
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其致死、致残率较高，因此是肿瘤治疗领域的最大难题之一。而早期的诊断和治疗成为治愈癌症的关键。在肿瘤的早期诊断方面，传统的影像技术只能了解肿瘤体积大小和解剖定位，而分子影像学技术能让我们获取更多有价值的信息，例如恶变前后的蛋白分子检测，肿瘤生长动力学评估，肿瘤细胞标记物等，且活体分子成像可以实现在无损生物体微环境的状况下进行发病机制的研究，并帮助显示复杂的分子运动轨迹。目前应用于临床的分子影像学技术主要包括CT成像、核磁共振成像(MRI)、荧光成像和超声成像等，不同的成像手段各有优劣。其中，MRI凭借其较高的空间分辨率、组织对比度及无电离辐射等，引起学者的广泛关注并在临床被广泛应用，但其灵敏度不高，常需通过注射对比剂而提高敏感性。而荧光成像具有无创性、非侵入性、高敏感性和实时性等特点，但存在空间分辨率低、解剖背景模糊、功能单一等限制。 多模态成像即将成像模态中的两种或三种联合使用，以达到发挥各模态优势、弥补不足的目的。如将核磁与光学成像融合，可在获得高分辨率图像的同时具有较高的检测灵敏度。其中，分子探针被认为是分子影像技术的先决条件。分子探针是从体外输入，进入体内后与细胞内靶分子特异性结合的成像对比剂，它必须具备以下几个条件：（1）具有高度的生物亲和性，能够参与人体正常的生理过程；（2）相对分子质量小，能够跨越人体内部的生理屏障，有效到达靶点以检测靶分子；（3）半衰期长，不能被机体迅速代谢，保证靶器官充分显像；（4）对靶点的识别标记具有高度的特异性和专一性。因此，临床医学界更加期望能开发出兼具两种或者多种成像模式的分子影像探针，进而弥补单一分子影像成像的不足之处。多模态探针研究中，最受关注的是基于纳米颗粒构建的多模成像探针。将靶向分子HA、配体分子DOTA结合到树状大分子上，包裹金纳米颗粒(AuNPs)然后将T1增强效果的Mn成功地螯合到DOTA上，从而制备出可实现CT/MR双模态成像的分子影像探针（中国专利技术专利：一种CT/MR双模态纳米探针及其制备方法，公开号：CN105412947A）。将靶向试剂叶酸、螯合试剂DOTA结合到树状大分子上，然后将放射核素99mTc成功地标记到DOTA上，从而制备出可实现MR/SPECT双模态成像的分子影像探针（中国专利技术专利：一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，公开号：CN104645363A ）。因此，在双模态探针技术基础上，结合 MR 成像与荧光成像，构建一种新型的靶向性双模态探针，以达到对脑胶质瘤实现靶向成像。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术提供一种靶向脑胶质瘤的磁性荧光双模态探针及其制备方法。为实现这样的目的，在本专利技术的技术方案中，以一定比例的无机铁盐和无机锌盐为原料，在有机酸作为表面活性剂。同时以碱、醇类和水作为溶剂，在一定温度时反应若干个小时，即可制高磁饱和值、高结晶度的、颗粒均一的Zn0.4Fe2.6O4 NPs。进一步地，以二巯基丁二酸（DMSA）作为表面活性剂进行两次水交换，即可得到稳定的水溶性纳米颗粒。进一步地，以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为偶联剂，将c(RGDyK)和荧光素与DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs进行连接，或是可以先利用DTDP活化巯基，再用巯基乙胺进行氨基化，接着连接羧基型荧光素，最后再把RGD键合到纳米颗粒表面对的羧基上。即可得到MR/荧光双模态探针材料。一种靶向脑胶质瘤的磁性荧光双模态探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）高生物相容性 Zn0.4Fe2.6O4磁性纳米颗粒的制备首先把FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O 和ZnSO4溶解在20ml的水里，使得前体达到1.73×10-3 mol Fe2+ ， 2.67×10-4 mol Zn2+ 的目的；其次，把10ml油酸、10ml水和1g NaOH混合，在常温下磁力搅拌直到得到均匀的溶液；再者，把前体Fe2+和Zn2+溶液倒进该均匀溶液中，搅拌几分钟以后，混合溶液变成深棕色；最后把该溶液转移进50ml反应釜中，密封，230度加热15个小时；反应结束以后，冷却至室温；产品沉积在釜底，用环己烷溶解取出纳米颗粒；再把乙醇加入容有纳米颗粒的环己烷中，沉淀出纳米颗粒，最后纳米颗粒再用乙醇反复洗数次；颗粒表面的有机表面活性剂用二巯基丁二酸（DMSA）在60℃水浴机械搅拌12小时，重复两次交换，得到DMSA包裹的锌掺杂的超顺磁四氧化三铁纳米颗粒；该纳米颗粒能够彻底溶解在水相中；（2）靶向MRI/荧光双模态探针的制备方法一：取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的盐酸调节PH；把上述溶液加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应；将混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中；把氨基荧光分子和c(RGDyK)溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室温避光反应4小时后4℃避光过夜；混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的游离荧光分子和抗体分子；即可得到靶向MRI/荧光双模态探针材料；方法二：（1）荧光标记DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs首先用2,2'-二硫二吡啶（DTDP）活化DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的巯基基团，具体为，把15mg DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs 分散在含有DTDP的PBS缓冲液中（10mM，pH8），常温下，活化反应在旋转搅拌器中过夜，离心（9000rcf，20min），把上清液中未反应的DTDP去除，把沉淀颗粒重新分散在含有巯基乙胺（Cyst）（15ml，120mM）的PBS（10mM，pH8）中，超声、常温下在旋转搅拌器中反应5个小时，透析48小时，去除未反应的巯基乙胺，离心（9000rcf，10min）得到含有氨基的Cyst-DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs沉淀，并重新分散在1ml的PBS（10mM，pH8）的缓冲液中，最后将羧基荧光物质加入其中进行反应过夜；用H2O/二甲基亚砜（DMSO），1:4，v/v，超滤离心洗去多余的游离荧光物质，即可得到MRI/荧光双模态探针材料；（2）靶向标记MRI/荧光双模态探针取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的盐酸调节PH，把上述溶液加入到荧光标记的Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应，将混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的荧光标记的Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中，把c(RGDyK)溶解本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向脑胶质瘤的磁性荧光双模态探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）高生物相容性 Zn0.4Fe2.6O4磁性纳米颗粒的制备首先把FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O 和ZnSO4溶解在20ml的水里，使得前体达到1.73×10‑3 mol Fe2+ ， 2.67×10‑4 mol Zn2+ 的目的；其次，把10ml油酸、10ml水和1g NaOH混合，在常温下磁力搅拌直到得到均匀的溶液；再者，把前体Fe2+和Zn2+溶液倒进该均匀溶液中，搅拌几分钟以后，混合溶液变成深棕色；最后把该溶液转移进50ml反应釜中，密封，230度加热15个小时；反应结束以后，冷却至室温；产品沉积在釜底，用环己烷溶解取出纳米颗粒；再把乙醇加入容有纳米颗粒的环己烷中，沉淀出纳米颗粒，最后纳米颗粒再用乙醇反复洗数次；颗粒表面的有机表面活性剂用二巯基丁二酸（DMSA）在60℃水浴机械搅拌12小时，重复两次交换，得到DMSA包裹的锌掺杂的超顺磁四氧化三铁纳米颗粒；该纳米颗粒能够彻底溶解在水相中；（2）靶向MRI/荧光双模态探针的制备方法一：取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的盐酸调节PH；把上述溶液加入到DMSA‑Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应；将混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的DMSA‑Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中；把氨基荧光分子和c(RGDyK)溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的DMSA‑Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室温避光反应4小时后4℃避光过夜；混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的游离荧光分子和抗体分子；即可得到靶向MRI/荧光双模态探针材料；方法二：（1）荧光标记DMSA‑Zn0.4Fe2.6O4 NPs首先用2,2'‑二硫二吡啶（DTDP）活化DMSA‑Zn0.4Fe2.6O4 NPs的巯基基团，具体为，把15mg DMSA‑Zn0.4Fe2.6O4 NPs 分散在含有DTDP的PBS缓冲液中（10mM，pH8），常温下，活化反应在旋转搅拌器中过夜，离心（9000rcf，20min），把上清液中未反应的DTDP去除，把沉淀颗粒重新分散在含有巯基乙胺（Cyst）（15ml，120mM）的PBS（10mM，pH8）中，超声、常温下在旋转搅拌器中反应5个小时，透析48小时，去除未反应的巯基乙胺，离心（9000rcf，10min）得到含有氨基的Cyst‑DMSA‑Zn0.4Fe2.6O4 NPs沉淀，并重新分散在1ml的PBS（10mM，pH8）的缓冲液中，最后将羧基荧光物质加入其中进行反应过夜；用H2O/二甲基亚砜（DMSO），1:4，v/v，超滤离心洗去多余的游离荧光物质，即可得到MRI/荧光双模态探针材料；（2）靶向标记MRI/荧光双模态探针取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的盐酸调节PH，把上述溶液加入到荧光标记的Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应，将混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的荧光标记的Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中，把c(RGDyK)溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的荧光标记的Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室温反应过夜，混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的游离的抗体分子，然后重悬于PBS 中；即可得到靶向MRI/荧光双模态探针材料。...
【技术特征摘要】
1.一种靶向脑胶质瘤的磁性荧光双模态探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）高生物相容性 Zn0.4Fe2.6O4磁性纳米颗粒的制备首先把FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O 和ZnSO4溶解在20ml的水里，使得前体达到1.73×10-3 mol Fe2+ ， 2.67×10-4 mol Zn2+ 的目的；其次，把10ml油酸、10ml水和1g NaOH混合，在常温下磁力搅拌直到得到均匀的溶液；再者，把前体Fe2+和Zn2+溶液倒进该均匀溶液中，搅拌几分钟以后，混合溶液变成深棕色；最后把该溶液转移进50ml反应釜中，密封，230度加热15个小时；反应结束以后，冷却至室温；产品沉积在釜底，用环己烷溶解取出纳米颗粒；再把乙醇加入容有纳米颗粒的环己烷中，沉淀出纳米颗粒，最后纳米颗粒再用乙醇反复洗数次；颗粒表面的有机表面活性剂用二巯基丁二酸（DMSA）在60℃水浴机械搅拌12小时，重复两次交换，得到DMSA包裹的锌掺杂的超顺磁四氧化三铁纳米颗粒；该纳米颗粒能够彻底溶解在水相中；（2）靶向MRI/荧光双模态探针的制备方法一：取EDC和NHS溶解在PBS缓冲液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的盐酸调节PH；把上述溶液加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超声10分钟，室温下反应；将混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的EDC和NHS，将活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS缓冲液中；把氨基荧光分子和c(RGDyK)溶解在PBS缓冲液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室温避光反应4小时后4℃避光过夜；混合物用PBS 缓冲液（PH=7.4， 0.01M）磁分离洗涤3 次以除去多余的游离荧光分子和抗体分子；即可得到靶向MRI/荧光双模态探针材料；方法二：（1）荧光标记DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs首先用2,2'-二硫二吡啶（DTDP）活化DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的巯基基团，具体为，把15mg DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs 分散在含有DTDP的PBS缓冲液中（10mM，pH8），常温下，活化反应在旋转搅拌器中过夜，离心（9000...
【专利技术属性】
技术研发人员：何丹农，祝闪闪，王萍，金彩虹，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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