MYH7‑A934V突变基因用于制备诊断肥厚型心肌病试剂盒的应用制造技术

本发明专利技术涉及MYH7‑A934V突变基因用于制备诊断肥厚型心肌病试剂盒的应用。本发明专利技术还涉及肥厚型心肌病诊断试剂盒，该试剂盒包括根据MYH7‑A934V突变基因设计的PCR引物。本发明专利技术提供了中国人群中存在MYH7基因的一种突变，并且说明了该突变基因与肥厚型心肌病的相关。利用本发明专利技术的试剂盒检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对肥厚型心肌病MYH7基因A934V突变的大规模的筛查和诊断。

MYH7 mutation of A934V gene in application for preparing kit for the diagnosis of hypertrophic cardiomyopathy

The present invention relates to MYH7 mutation of A934V gene in application for preparing kit for the diagnosis of hypertrophic cardiomyopathy. The invention also relates to a hypertrophic cardiomyopathy diagnosis kit, the kit includes a PCR primer according to MYH7 gene A934V mutation design. The present invention provides a mutation in the MYH7 gene in the Chinese population, and illustrates the association between the mutant gene and hypertrophic cardiomyopathy. The kit has the advantages of simple detection method, low cost, direct and reliable detection results, and is suitable for large-scale screening and diagnosis of A934V mutation of MYH7 gene in hypertrophic cardiomyopathy.

【技术实现步骤摘要】
MYH7-A934V突变基因用于制备诊断肥厚型心肌病试剂盒的应用
本专利技术涉及肥厚型心肌病的基因诊断试剂盒，更具体地说是一种利用MYH7基因A934V突变检测的试剂盒，该试剂盒及方法可用于该疾病的辅助诊断和早期诊断，属于生物

技术介绍
肥厚型心肌病(HypertrophicCardiomyopathy，HCM),是一种以心肌进行性肥厚、心室腔进行性缩小为特征，以左心室血液充盈受阻、舒张期顺应性下降为基本病理特点的心肌疾病。肥厚型心肌病是最常见的常染色体显性遗传性心血管疾病。其发病率为1:500，以此推算中国有260万的肥厚型心肌病人，但这个发病率是被低估的。而且很多肥厚型心肌病的临床表现比较多样主要可无症状或轻度胸闷、胸痛、心悸，并发房颤、室性心律失常、心力衰竭、心源性猝死等，其中心源性猝死为年轻人猝死的首要原因，而往往在疾病早期发生猝死的年轻人很多，这可能与疾病的早期无症状未被发现或者不重视有关。因此肥厚型心肌病人的早期诊断尤为重要。
技术实现思路
本专利技术通过对1例肥厚型心肌病的家系成员及200名正常的对照成员MYH7基因进行筛查，发现肥厚型心肌病患者具有MYH7-A934V突变位点。200名正常人的筛查未检测到该突变，说明该突变位点与肥厚型心肌病基因密切相关。基于上述发现，本专利技术提供了MYH7-A934V突变基因用于制备诊断肥厚型心肌病试剂盒的应用。本专利技术还提供了一种肥厚型心肌病诊断试剂盒，所述试剂盒包括根据MYH7-A934V突变基因设计的PCR引物。一种实施方式中，本专利技术的根据MYH7-A934V突变基因设计的PCR引物为：MYH7-A934V-F：5’-TTCTCTGTTGCGTGTTTCTC-3’；MYH7-A934V-R：5’-TCCCCTCTGTTCCTCACCTT-3’。一种实施方式中，本专利技术的试剂盒包括：20ul10XPCR缓冲液，4ul10mMdNTP混合液，2ul5unit/ul的TaqDNA聚合酶，10ul10pmol/ulMYH7-A934V-F：5’-TTCTCTGTTGCGTGTTTCTC-3’，10ul10pmol/ulMYH7-A934V-R：5’-TCCCCTCTGTTCCTCACCTT-3’。本专利技术的一个实施方案中提供一个检测MYH7基因突变的试剂盒，本试剂盒内装有用以检测MYH7基因A934V突变的成分，与之同时提供可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中MYH7基因突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述的一对MYH7-A934V-F和MYH7-A934V-R引物，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。本专利技术通过超声医学科门诊收集肥厚型心肌病患者，在患者及家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式。然后应用酚氯仿抽提方法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA均准确对应登记的患者临床资料。根据PrimerPremier5.0进行设计引物，包含MYH7基因A934V位点及两侧序列，进行PCR扩增。对PCR产物进行直接测序：测序引物与PCR扩增引物相同，应用ABI公司3730DNA测序仪进行正反向测序。将得到的序列与Genbank中的标准序列比对，确定A934V突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定MYH7基因突变位点。以肥厚型心肌病人作为研究对象，通过对4例该病家系成员及200例正常对照的MYH7基因编码区外显子的筛查，发现一名患者在外显子3上具有MYH7基因新的突变。该患者为一杂合子。这个突变在200例对照组中均未被发现，说明这一变位点与MYH7基因相关。MYH7基因的A934V错义突变，使得丙氨酸突变为缬氨酸，氨基酸发生了改变，A934位也是物种间高度保守序列，因此为蛋白质重要的功能区域，该位点发生的氨基酸改变会影响蛋白的功能进而发生疾病。本专利技术提供了中国人群中存在MYH7基因的一种突变，并且说明了该突变基因与肥厚型心肌病的相关。同时，利用本专利技术的试剂盒检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对肥厚型心肌病MYH7基因A934V突变的大规模的筛查和诊断。附图说明图1为MYH7基因外显子23的部分测序结果，A为野生型即未发生突变的碱基序列；B为杂合型即发生碱基突变的序列。图2为某家系三代HCM家系图，图中方框代表男性，圆圈代表女性，涂黑为HCM患者，空心为正常人，斜线代表死亡，+号代表MYH7-A934V,-号代表不携带MYH7-A934V。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步叙述，以使公众对
技术实现思路
有更深入的了解，并非对本专利技术的限制，凡依照本专利技术公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利技术的保护范围。专利技术人对肥厚型心肌病基因、影像和临床综合预测猝死的转化研究，对中国肥厚型心肌病家系先证者进行高通量捕获测序技术的多基因检测,检测结果进行家系验证，得到与疾病密切相关的遗传变异。前期通过超声科门诊收集肥厚型心肌病患者，在患者及家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式。并对病人及正常家属进行二维超声心动图，十二导联心电图。病人再加做24小时动态心电图，心脏核磁共振，超声负荷心动图。本研究已得到了本单位伦理委员会批准。专利技术人利用肥厚型心肌病相关的96个基因高通量靶向外显子捕获技术对308个肥厚型心肌病家系先证者进行检测，生物信息学分析过滤良性变异，再对所有家系先证者及家属进行一代测序验证及基因型与临床表型的共分离的家系验证，再次过滤良性变异，找出可能致病突变。在这些家系中HCM798家系，如图2所示。通过生物信息学分析和家系验证后，结果显示所有HCM患者均携带MYH7-A934V基因变异,如图1所示。且家系中除年龄小于十岁的两名家属携带MYH7-A934V基因突变位点未表现为HCM，可能还未到发病年龄，其余未携带该突变位点的均为正常人，在200名正常人中也未发现该突变位点，正常人数据库中也未发现该变异位点，因此该变异很可能为致肥厚型心肌病的致病突变位点。因此致病性分析及家系验证时发现了MYH7基因A934V突变位点属于HCM798家系的可能致病基因突变位点。专利技术人查阅了HGMD数据库及ClinVar数据库均为未报道的突变位点，属于新发现的致病突变位点。实施例1：MYH7基因A934V杂合突变的检测方法一.研究对象通过超声科门诊收集肥厚型心肌病患者，在患者及家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式。本研究已得到了本单位伦理委员会批准。二.制备基因组DNA第一天1.在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5-10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清；2.加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15本文档来自技高网...

【技术保护点】
MYH7‑A934V突变基因用于制备诊断肥厚型心肌病试剂盒的应用。

【技术特征摘要】
1.MYH7-A934V突变基因用于制备诊断肥厚型心肌病试剂盒的应用。2.一种肥厚型心肌病诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括根据MYH7-A934V突变基因设计的PCR引物。3.如权利要求1所述的肥厚型心肌病诊断试剂盒，其特征在于：所述根据MYH7-A934V突变基因设计的PCR引物为：MYH7-A934V-F：5’-TTCTCTGTTGCGTGTTTCTC-3’；MYH7-A934V-R：5’-TCCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽文，王博，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61