分子信标探针及引物对、VDR基因SNPs位点检测方法技术

本发明专利技术公开一组分子信标探针及引物对、VDR基因SNPs位点检测方法。该分子信标探针包括第一探针和第二探针；第一探针包含第一核心序列5’‑TGGGC[A/C]CCTCACTGCTCA‑3’，第二探针包含第二核心序列5’‑GGATGGCCTC[A/G]ATCAGC‑3’；同时，第一探针和第二探针的长度均为20‑30bp，Tm值均为62‑65℃，第一探针的5’端和3’端分别用第一荧光分子和第一淬灭分子标记，第二探针的5’端和3’端分别用第二荧光分子和第二淬灭分子标记。本发明专利技术仅需要qPCR仪和该两条荧光标记的探针就可实现对大量样本的VDR基因中两个重要多态性位点的分析，大大降低了检测成本和分析难度。

Molecular beacon probe and primer pair, VDR gene SNPs site detection method

The present invention discloses a set of molecular beacon probes, primer pairs and VDR gene SNPs loci detection methods. The molecular beacon probe comprises first and second probes; the first probe includes a first core sequence 5 'TGGGC[A/C]CCTCACTGCTCA 3', second probe contains second core sequence 5 'GGATGGCCTC[A/G]ATCAGC 3'; at the same time, the length of the first and second probes were 20 30bp, Tm = 62 65 C, the first the probe 5 'and 3' ends respectively with the first and the first molecular fluorescence quenching molecular marker, second probe 5 'and 3' ends of second and second respectively by fluorescence quenching of molecular markers. The invention only needs the qPCR instrument and the two fluorescent labeled probes, which can realize the analysis of two important polymorphic loci in a large sample of VDR gene, and greatly reduces the detection cost and the analysis difficulty.

【技术实现步骤摘要】
分子信标探针及引物对、VDR基因SNPs位点检测方法
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一组分子信标探针及引物对、VDR基因SNPs位点检测方法。
技术介绍
维生素D受体(vitaminDreceptor，VDR)是细胞表面结合1,25-二羟维生素D(1,25-dihyroxyvitaminD，1,25(OH)2D，也叫钙三醇，calcitriol)的受体。当VDR与激素性质的1,25(OH)2D结合而活化后，便进入胞核内，与视黄醇-X受体形成异二聚体结合到特定基因的激素反应元件上，调节基因表达或转录抑制。因此，VDR也是一种核受体转录因子，即NR1I1(nuclearreceptorsubfamily1,groupI,member1)，其调节的基因涉及钙磷代谢、细胞生长、增殖和凋亡，并进而与骨骼健康、免疫反应和肿瘤等过程相关。VDR基因在人染色体上定位于12q13.11，具有500种以上的单核苷酸多态性位点和相应基因型，其中，Apa1、Cdx2、EcoRV、Bsm1、Fok1、Taq1、Tru9I是早期采用限制性酶切片段长度多态性分析发现的SNPs，并且在过去一段时间积累了大量关于它们和多种健康与疾病现象相关的报道。VDR的RNA产物由9个外显子构成，Apa1位点(rs7975232)位于第8号内含子3’端，为[A/C]二态性，Taq1位点(rs731236)位于第9号外显子5’端，为[C/T]二态性，二者相距较近。其中，在外显子上的Taq1多态性并不改变对应的异亮氨酸，为同义突变。但位于内含子上的SNPs或位于外显子上氨基酸不变的SNPs可能与mRNA转录、剪接、密码子翻译效率等过程相关，因此，仍可能影响疾病风险。对Apa1和Taq1多态性的分析显示，二者与肺结核疗效、高加索人骨折与银屑病风险、胰岛素抵抗、哮喘和遗传过敏、腰椎病相关；Taq1可能与男性帕金森病、汉族2型糖尿病合并胫前皮肤黑斑、骨密度、高体质指数、系统性红斑狼疮预后等疾病风险相关；ApaI与亚洲人的牙龈炎、我国北方和土耳其人的银屑病、肾细胞癌和散发性前列腺癌有关。因此，对人群的这两个SNPs进行检测，对分析VDR与多种疾病风险和表型的相关性具有研究与预测价值。虽然等位基因检测的方法有数十种，但针对VDRApa1和Taq1两个SNPs的基因型分析，目前报道的方法主要是：聚合酶链式反应后的限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、TaqMan探针、高分辨率熔解曲线分析(HRM)、多重PCR结合标签阵列单碱基技术、时间飞行质谱法、测序等。PCR-RFLP虽然廉价，但其操作步骤繁琐，且需要两个独立的RFLP实验进行基因分型，在分析大量样本时，尤其费时。以TaqMan探针不论混合还是单独反应分析这两个SNPs，都需精心设计、测试多套探针，增加了试剂成本。HRM技术存在部分非典型曲线难以判断的不足。时间飞行质谱、测序等方法都依赖于昂贵的设备、封闭的试剂和较高的实验操作技术，甚至需要摸索建立适宜的检测条件；且因其单次运行所需试剂用量有最低要求，间歇与随时开机运行的成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一组分子信标探针及引物对、VDR基因SNPs位点检测方法，旨在解决现有VDR基因SNPs位点检测步骤繁琐、耗时、成本高的技术问题。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一方面，本专利技术提供一组用于检测VDR基因SNPs位点的分子信标探针，包括第一探针和第二探针，所述第一探针用于检测VDR基因的多态性位点Apa1，所述第二探针用于检测VDR基因的多态性位点Taq1；其中，所述第一探针包含第一核心序列5’-TGGGC[A/C]CCTCACTGCTCA-3’，所述第二探针包含第二核心序列5’-GGATGGCCTC[A/G]ATCAGC-3’；同时，所述第一探针和所述第二探针的长度均为20-30bp，Tm值均为62-65℃，所述第一探针的5’端和3’端分别用第一荧光分子和第一淬灭分子标记，所述第二探针的5’端和3’端分别用第二荧光分子和第二淬灭分子标记。另一方面，本专利技术提供一组用于检测VDR基因SNPs位点的分子信标探针和引物对，所述分子信标探针为上述分子信标探针，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物和所述第二引物的长度均为17-25bp；且所述第一引物包含5’-GTTGAGT-3’，所述第二引物包含5’-GGATGTAC-3’。再一方面，本专利技术提供一种用于检测VDR基因SNPs位点的试剂盒，包括上述分子信标探针和引物对，还包括TaqHS酶、dNTPs、PCR缓冲液。最后，本专利技术提供一种VDR基因SNPs位点的检测方法，包括如下步骤：提取DNA样本；将所述DNA样本与上述试剂盒配成PCR反应体系，进行PCR扩增；根据所述扩增结果分析样本中VDR基因SNPs位点。本专利技术提供的该组分子信标探针中，第一探针的核苷酸序列可覆盖VDR基因的多态性位点Apa1(rs7975232)，第二探针的核苷酸序列可覆盖VDR基因的多态性位点Taq1(rs731236)，这样，仅需要qPCR仪和该两条荧光标记的探针，即可实现对大量样本的VDR基因中该两个重要多态性位点的分析，加上qPCR仪运行成本和操作技术要求相对较低，这就大大降低了检测成本和分析难度。同时，设计一组与该两条探针配套的引物对，一条(第一引物)位于Apa1上游100bp范围内的特异性引物，另一条(第二引物)位于Taq1下游100bp范围内的特异性引物。Apa1上游100bp的适宜引物都有共同位置上7bp的片段5’-GTTGAGT-3’，Taq1下游100bp的适宜引物都有共同位置上8bp的片段5’-GGATGTAC-3’；这样可实现对大量样本的VDR基因中两个重要多态性位点的分析。该用于检测VDR基因SNPs位点的试剂盒，因含有本专利技术特有的该组分子信标探针和引物对，所以具有高效、灵敏、特异性强的特点，而且该试剂盒成本低、使用方便，仅需要qPCR仪可实现对大量样本的VDR基因中两个重要多态性位点的分析。该VDR基因SNPs位点的检测方法，因使用本专利技术特有的试剂盒，根据荧光信号在熔解曲线程序中出现的峰型判断VDR不同的基因型。因此具有检测步骤简单、耗时少、成本低的特点。附图说明图1为本专利技术实施例2中FAM通道荧光信号原始数据图；图2为本专利技术实施例2中FAM通道荧光信号原始数据处理图；图3为本专利技术实施例2中HEX通道荧光信号原始数据图；图4为本专利技术实施例2中HEX通道荧光信号原始数据处理图；图5为本专利技术实施例2中PCR检测产物测序结果图；其中，附图标记为：1：一号样本(多态性：A/C-T/T)；2：二号样本(多态性：C/C-T/T)；3：三号样本(多态性：A/C-C/T)；4：四号样本(多态性：A/A-C/T)；5：五号样本(多态性：A/A-T/T)；6：六号样本(多态性：A/A-C/C)。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一方面，本专利技术实施例提供了一组用于检测VDR基因SNPs位点的分子信标探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测VDR基因SNPs位点的分子信标探针，其特征在于，包括第一探针和第二探针，所述第一探针用于检测VDR基因的多态性位点Apa1，所述第二探针用于检测VDR基因的多态性位点Taq1；其中，所述第一探针包含第一核心序列5’‑TGGGC[A/C]CCTCACTGCTCA‑3’，所述第二探针包含第二核心序列5’‑GGATGGCCTC[A/G]ATCAGC‑3’；同时，所述第一探针和所述第二探针的长度均为20‑30bp，Tm值均为62‑65℃，所述第一探针的5’端和3’端分别用第一荧光分子和第一淬灭分子标记，所述第二探针的5’端和3’端分别用第二荧光分子和第二淬灭分子标记。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测VDR基因SNPs位点的分子信标探针，其特征在于，包括第一探针和第二探针，所述第一探针用于检测VDR基因的多态性位点Apa1，所述第二探针用于检测VDR基因的多态性位点Taq1；其中，所述第一探针包含第一核心序列5’-TGGGC[A/C]CCTCACTGCTCA-3’，所述第二探针包含第二核心序列5’-GGATGGCCTC[A/G]ATCAGC-3’；同时，所述第一探针和所述第二探针的长度均为20-30bp，Tm值均为62-65℃，所述第一探针的5’端和3’端分别用第一荧光分子和第一淬灭分子标记，所述第二探针的5’端和3’端分别用第二荧光分子和第二淬灭分子标记。2.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述第一探针的核苷酸序列为SEQIDNO:1：CTTGGGCCCCTCACTGCTCAAG；所述第二探针的核苷酸序列为SEQIDNO:2：CGCGGATGGCCTCAATCAGCGCG。3.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述第一荧光分子和所述第二荧光分子均为FAM、HEX、TET、VIC、ROX、CY5、CY3、JOE、ALEX和CAL中的任意一种，且所述第一荧光分子和所述第二荧光分子为不同的荧光分子；和/或所述第一淬灭分子和所述第二淬灭分子均为DAB、BHQ、ECLIPSE和TAMRA中的任意一种。4.一组用于检测VDR基因SNPs位点的分子信标探针和引...

【专利技术属性】
技术研发人员：周继昌，刘小立，朱玉梅，杨应周，梁雄顺，徐远飞，周小英，车晓玲，
申请(专利权)人：深圳市慢性病防治中心，
类型：发明
国别省市：广东,44