肺炎致病菌快速识别基因芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种肺炎致病菌快速识别的基因芯片。该基因芯片可以检测肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体15种致病菌，其中包括了临床常见的和难培养的肺炎致病菌。在其制备过程中，采用了每种肺炎致病菌所对应的16S rDNA和特异基因序列进行探针的设计、筛选和验证，分别从“属”和“种”的级别同时对待检测样品中细菌的种类进行鉴定。本发明专利技术芯片弥补了目前临床肺炎致病菌检测不及时不全面的缺陷，为肺炎患者早诊断、早治疗提供了一种新的检测手段。

Rapid identification of pathogenic bacteria in pneumonia by gene chip

The invention discloses a gene chip for rapid identification of pathogenic bacteria of pneumonia. The gene chip can detect Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter Bauman, Enterococcus faecalis, Enterococcus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Stenotrophomonas maltophilia, Burke Holder, from onion Legionella and Chlamydia pneumoniae 15 kinds of pathogenic bacteria, including clinical common and difficult to cultivate the pathogen of pneumonia. In the process of preparation, design, screening and verification using 16S rDNA and specific gene sequence of each pathogen of pneumonia corresponding probes, species respectively from the \Genus\ and \kind\ level at the same time to detection of bacteria in samples were identified. The chip of the invention makes up for the defect that the clinical detection of the pathogenic bacteria of pneumonia is not timely and incomplete, and provides a new detection means for early diagnosis and treatment of pneumonia patients.

【技术实现步骤摘要】
肺炎致病菌快速识别基因芯片
本专利技术涉及基因技术，尤其涉及肺炎致病菌快速识别基因芯片。
技术介绍
近年来，由于空气污染的加剧及公共卫生事件的发生，呼吸道疾病引起越来越多的关注。肺炎是指包括终末气道，肺泡和肺间质等在内的肺实质性炎症，是全球感染性疾病死亡的首要原因[1]。据世界卫生组织(WHO)统计，每年约有350万人死于下呼吸道感染，居所有死亡原因的第三位[2]。在美国,肺炎和流行性感冒位于所有死因的第九位，2010年和2011年均有5万多人死于肺炎[3-5]，而且该统计没有将肺炎导致的败血症以及死于肺炎并发症的癌症、帕金森等病例纳入肺炎组，所以实际因肺炎死亡的人数比这个数还要高[2]。在我国，每年至少有250万人罹患肺炎，农村多于城市，其中5岁以下儿童肺炎死亡率为184/10万—1223万/10万[6]，老年肺炎病死率没有确切的数据，但据黄华瑞报道[7]老年肺炎明显高于其他年龄段。可见，肺炎严重威胁着人类的生命健康。肺炎的致病原有很多，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等，其中最重要最常见的是细菌。众所周知，肺炎按照发病环境可分为社区获得性肺炎(CAP)和医院获得性肺炎(HAP)。大部分CAP患者只需要门诊就诊，但仍有大约20％的患者仍需住院治疗[8]。CAP致病菌以革兰氏阳性菌为主，其中又以肺炎链球菌为第一位，占35-80％，其次为流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，肺炎支原体，肺炎衣原体，金黄色葡萄球菌等[9]。HAP致病菌比较广泛，以革兰氏阴性菌为主，其中常见的是铜绿假单胞菌，大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，鲍曼不动杆菌，其它还有嗜麦芽窄食单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌，粪肠球菌，屎肠球菌，阴沟肠杆菌等，此外革兰氏阳性菌金葡菌也见于HAP，尤其是耐甲氧西林金葡菌(MRSA)[10]。因此，肺炎致病菌种类繁多，准确、快速、特异和灵敏的检测手段是肺炎早诊断、早治疗的有力保障。明确肺炎致病菌的种类是肺炎早诊断、及时采取有效治疗措施、减少肺炎病死率的重要环节。传统的细菌培养分离鉴定方法是目前常规的细菌分离鉴定的检测方法。传统细菌培养分离鉴定方法是基于细菌生长形态学以及细菌所特有的酶对营养基质分解能力的不同，利用其代谢产物产酸、产气等生化特性进行鉴定的一种方法，是细菌分类鉴定的金标准，但该方法需要培养分离，耗时长，一般需要24-48小时，鉴定生化试验繁杂，对于培养条件苛刻的细菌不但所需时间更长而且检出率低[17]。细菌自动化鉴定系统如Vitek-AMS、MicroScan、Biolog等，虽然简化了手工操作，但仪器中数据库还不完善，模式菌种数量有限，一些细菌只能鉴定到属，对于结果有疑问的仍然需要手工鉴定。细菌血清学抗体的检测是一种快速检测方法，但不同的抗体产生的时间是不同的，如肺炎支原体IgM抗体在起病后大约2周产生，不能满足临床快速诊断的需求，而且灵敏度和特异度均不理想。美国传染病学会(IDSA)指南曾建议要在8小时内给予肺部感染患者抗生素治疗，而这一时间在2003年缩短到4小时[19,20]，可见，细菌的培养分离鉴定远远不能满足临床快速诊断的需求，肺炎早期的治疗只能依靠经验性治疗，这样又进一步加剧了耐药菌株的产生，因此，临床急需一种准确、快速检测肺炎致病菌的方法。基因芯片技术是20世纪80年代末在人类基因组测序计划完成的背景下发展起来的一种微型化、高通量的新生物学技术，广泛的应用于疾病的诊断和治疗[21]、新基因的发现[22]、单核苷酸多态性分析[23]、环境微生物监测[24]、药物筛选[25]、病原微生物检测[26]等领域。在微生物学方面基因芯片技术有2个最普通的应用，一是全基因组的转录水平表达谱分析，二是监测不同条件下细胞基因表达的差异或不同环境中微生物DNA的突变情况和生物学特性的改变[27,28]。基因芯片是通过碱基互补的原理，在引物或探针上标记可检测的物质，将探针固定于支持物上，与待检样品进行杂交，通过杂交的信号进行结果判读。常用的标记染料有Cy3和Cy5荧光染料及其生物素分子，其中生物素-链霉亲和素显色方法，可以通过辣根过氧化物酶进行显色和酪胺信号放大技术进行结果判读，该方法价格相对便宜，更容易被临床接受。
技术实现思路
鉴于上述问题，本专利技术旨在提出一种肺炎致病菌快速识别基因芯片，其能快速鉴定肺炎致病菌。本专利技术的肺炎致病菌快速识别基因芯片，其中，所述肺炎致病菌包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体中的至少一种；所述基因芯片上包括至少一个探针，用于与待检样品进行杂交；所述至少一个探针中的每个探针对应于所述肺炎致病菌中的至少一种；所述至少一个探针包括至少一个第一探针；一个所述第一探针对应于所述肺炎致病菌中的一种病菌；所述第一探针用于鉴定与其对应的所述的肺炎致病菌的特异基因，由此确定被测细菌的种；其中，用于鉴定所述肺炎链球菌的第一探针的序列为：CAAAGTAGTACCAAGTGCCATTGATTTTCTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述金黄色葡萄球菌的第一探针的序列为：CAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述流感嗜血杆菌的第一探针的序列为：GAACGTGGTACACCAGAATACAACATCGCTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎支原体的第一探针的序列为：TGAGGTGAATGGGTTGTTGAATCCGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述铜绿假单胞菌的第一探针的序列为：TTGTGCCTGCTCGACCCGCTGGACGGGGTCTACAACTACCTCGCCCAGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述鲍曼不动杆菌的第一探针的序列为：TCGATCCACGTGCTAAAGTGATTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述粪肠球菌的第一探针的序列为：TTACATGGGCCAAATGGTGAAGATGGAACATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述屎肠球菌的第一探针的序列为：TCCTTTTTCCGTCATCAGTATAAAGTATAGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎克雷伯杆菌的第一探针的序列为：AAAGCCGGCGTGTACGATAATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述大肠埃希菌的第一探针的序列为：CGCCAAATCCGCAACGTAATGACAGTGTACCAACCCTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述阴沟肠杆菌的第一探针的序列为：GCAGGCGATCTGTACGTTCAGGTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述嗜麦芽窄食单胞菌的第一探针的序列为：TACCACCCGTACCTGGACTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述洋葱伯克霍尔德菌的第一探针的序列为：TGGTGCGCTCGGGCTCGATCGACATTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述嗜肺军团菌的第一探针的序列为：ATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎衣原体中的第一探针的序列为：ACTGCCGTAGATAGACCTAACCCGGCCTATTTTTTTTTTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺炎致病菌快速识别基因芯片，其中，所述肺炎致病菌包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体中的至少一种；所述基因芯片上包括至少一个探针，用于与待检样品进行杂交；所述至少一个探针中的每个探针对应于所述肺炎致病菌中的至少一种；所述至少一个探针包括至少一个第一探针；一个所述第一探针对应于所述肺炎致病菌中的一种病菌；所述第一探针用于鉴定与其对应的所述的肺炎致病菌的特异基因，由此确定被测细菌的种；其中，用于鉴定所述肺炎链球菌的第一探针的序列为：CAAAGTAGTACCAAGTGCCATTGATTTTCTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述金黄色葡萄球菌的第一探针的序列为：CAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述流感嗜血杆菌的第一探针的序列为：GAACGTGGTACACCAGAATACAACATCGCTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎支原体的第一探针的序列为：TGAGGTGAATGGGTTGTTGAATCCGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述铜绿假单胞菌的第一探针的序列为：TTGTGCCTGCTCGACCCGCTGGACGGGGTCTACAACTACCTCGCCCAGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述鲍曼不动杆菌的第一探针的序列为：TCGATCCACGTGCTAAAGTGATTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述粪肠球菌的第一探针的序列为：TTACATGGGCCAAATGGTGAAGATGGAACATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述屎肠球菌的第一探针的序列为：TCCTTTTTCCGTCATCAGTATAAAGTATAGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎克雷伯杆菌的第一探针的序列为：AAAGCCGGCGTGTACGATAATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述大肠埃希菌的第一探针的序列为：CGCCAAATCCGCAACGTAATGACAGTGTACCAACCCTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述阴沟肠杆菌的第一探针的序列为：GCAGGCGATCTGTACGTTCAGGTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述嗜麦芽窄食单胞菌的第一探针的序列为：TACCACCCGTACCTGGACTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述洋葱伯克霍尔德菌的第一探针的序列为：TGGTGCGCTCGGGCTCGATCGACATTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述嗜肺军团菌的第一探针的序列为：ATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎衣原体中的第一探针的序列为：ACTGCCGTAGATAGACCTAACCCGGCCTATTTTTTTTTTTT。...

【技术特征摘要】
1.一种肺炎致病菌快速识别基因芯片，其中，所述肺炎致病菌包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体中的至少一种；所述基因芯片上包括至少一个探针，用于与待检样品进行杂交；所述至少一个探针中的每个探针对应于所述肺炎致病菌中的至少一种；所述至少一个探针包括至少一个第一探针；一个所述第一探针对应于所述肺炎致病菌中的一种病菌；所述第一探针用于鉴定与其对应的所述的肺炎致病菌的特异基因，由此确定被测细菌的种；其中，用于鉴定所述肺炎链球菌的第一探针的序列为：CAAAGTAGTACCAAGTGCCATTGATTTTCTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述金黄色葡萄球菌的第一探针的序列为：CAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述流感嗜血杆菌的第一探针的序列为：GAACGTGGTACACCAGAATACAACATCGCTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎支原体的第一探针的序列为：TGAGGTGAATGGGTTGTTGAATCCGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述铜绿假单胞菌的第一探针的序列为：TTGTGCCTGCTCGACCCGCTGGACGGGGTCTACAACTACCTCGCCCAGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述鲍曼不动杆菌的第一探针的序列为：TCGATCCACGTGCTAAAGTGATTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述粪肠球菌的第一探针的序列为：TTACATGGGCCAAATGGTGAAGATGGAACATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述屎肠球菌的第一探针的序列为：TCCTTTTTCCGTCATCAGTATAAAGTATAGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎克雷伯杆菌的第一探针的序列为：AAAGCCGGCGTGTACGATAATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述大肠埃希菌的第一探针的序列为：CGCCAAATCCGCAACGTAATGACAGTGTACCAACCCTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述阴沟肠杆菌的第一探针的序列为：GCAGGCGATCTGTACGTTCAGGTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述嗜麦芽窄食单胞菌的第一探针的序列为：TACCACCCGTACCTGGACTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述洋葱伯克霍尔德菌的第一探针的序列为：TGGTGCGCTCGGGCTCGATCGACATTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述嗜肺军团菌的第一探针的序列为：ATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎衣原体中的第一探针的序列为：ACTGCCGTAGATAGACCTAACCCGGCCTATTTTTTTTTTTT。2.如权利要求1所述的肺炎致病菌快速识别基因芯片，其特征在于：所述至少一个探针包括至少一个第二探针；所述第二探针用于鉴定与其对应的所述的肺炎致病菌的16SrDNA基因，由其确定被测细菌的属；其中，用于鉴定所述肺炎链球菌的第二探针的序列为：TGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述金黄色葡萄球菌的第二探针的序列为：ACATATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACGGTATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述流感嗜血杆菌的第二探针的序列为：GAGGAAGGTTGATGTGTTATTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述肺炎支原体的第二探针的序列为：GACCTGCAAGGGTTCGTTTTTTTTTTTTT；用于鉴定所述铜绿假单胞菌的第二探针的序列为：TTGCTGTTTTGACG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈良安，马秀清，王升启，刘琪琦，李春笋，梁志欣，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11