一种血液循环肿瘤DNA点突变检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血液循环肿瘤DNA点突变检测方法。本发明专利技术提供的成套引物，包括扩增突变型靶序列的特异性引物和阻断序列；所述突变型靶序列为所述突变型cfDNA含有突变位点的区域；所述扩增突变型靶序列的特异性引物由突变型上游引物和突变型下游引物组成；所述突变型上游引物和所述突变型下游引物均与所述突变型靶序列结合，且所述突变型下游引物的3’末端最后一个碱基与所述突变型靶序列中位于所述突变位点的突变碱基互补；所述阻断序列与野生型靶序列中含有野生型碱基片段互补。本发明专利技术的方法具有敏感性高、特异性强、耗时短和成本低的优点，且可以同时检测多个指标。

A method for detecting DNA point mutation in blood circulation tumor

The invention discloses a method for detecting DNA point mutation of blood circulation tumor. The invention provides a complete set of primers, including amplification and blocking sequence specific primers of mutant target sequence; the mutation region containing the mutation site type target sequence for the mutant cfDNA; the specificity of the amplification primers mutant target sequence composed of mutant upstream primer and downstream primer of the mutant; mutation type upstream primer and the mutant primers were with the mutant target sequence binding, and the 3 'end of the mutant primer of the last base and the mutant target sequence mutation located at the mutation site of complementary base; the blocking sequence and the target sequence in the wild type containing the wild type nucleotide fragment complementation. The method of the invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity, short time consuming and low cost, and can simultaneously detect a plurality of indexes.

【技术实现步骤摘要】
一种血液循环肿瘤DNA点突变检测方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种血液循环肿瘤DNA点突变检测方法。
技术介绍
cfDNA存在于人体循环系统这一发现加强了其在不同临床领域的研究，cfDNA检测最大的进步是近期被批准可以用于胎儿性别鉴定。1948年Mandel和Metais使用高氯酸沉淀的方法在人血浆和血清中检测出cfDNA,但是这一发现在当时没有引起大家的关注，30–40年后cfDNA吸引了很多小组的研究，其中Leon他们发现癌症患者体内cfDNA浓度显著增高，而Stroun则证实cfDNA源自肿瘤并携带肿瘤的分子学特征，由此诞生了“液体活检”这一概念。由于cfDNA检测可以提供很多诊断、治疗和预后信息，一些研究人员正在集中研发新的技术，它可以通过分析癌症患者体内血浆或血清中cfDNA来发现和描述肿瘤细胞遗传学和表观遗传变异特征，通过检测cfDNA突变，实现肿瘤靶向治疗、个性化治疗的监测改变癌症患者的管理护理模式。cfDNA分析近期已用于产前诊断并用于其它临床领域的检测，如：自身免疫性疾病、创伤、脓毒症和心肌梗死。虽然有集中的研究，但是基于cfDNA的实验很少转化为临床应用。用于检测和描述癌症患者体内cfDNA特征的几项技术虽得到发展，包括限制性片段长度多态性、直接测序、高分辨率溶解分析、数字PCR、低温PCR和其它一些技术，但通常仅用于肿瘤组织分析。cfDNA浓度作为癌症标记物尚未得到证实，因为大量的数据显示癌症患者血浆中的cfDNA浓度由几纳克每毫升到几千纳克每毫升，与健康人体内cfDNA的浓度有很大范围的重叠，此外发现肿瘤患者体内cfDNA片段与正常对照者相比，或低、或相当或高于正常对照，这些现象就目前对cfDNA知识的了解无法得到解释。长期以来循环总DNA浓度被设想作为一个潜在的肿瘤标记物，但是健康人和癌症患者体内cfDNA浓度已经被证实有部分重叠，这点限制了其在临床上的应用。最近用现有的方法和特别设计一个特定的PCR体系，发现健康受试者和癌症受试者之间存在统计学意义上的差异。cfDNA分析为肿瘤病人提供了一种非侵入性的肿瘤分子检测方法，特别是用于检测遗传或表观遗传改变，如点突变或单核苷酸多态性、微卫星变异、甲基化或拷贝数变异，特别是在过去的十年里利用点突变对癌症类型的研究。对诸如ALK、EGFR、BRAF或KRAS点突变的研究，可以作为筛选靶向治疗肺癌、黑色素瘤或结肠癌的一个先决条件，这是cfDNA最先应用的领域。突变检测的标本通常来源于肿瘤组织，主要是原发性肿瘤，血液活检则很少应用。通过表1可以看出与肿瘤组织分析相比，血浆cfDNA分析具有很多的优势。循环肿瘤细胞DNA(ctDNA)点突变的检测方法必须非常灵敏，据推测癌症病人ctDNA中不到0.001％携带有特异的基因突变，为此很多荧光定量PCR技术得以发展，例如ARMS-PCR(突变扩增系统，又称等位基因特异性扩增法)、TaqMAN和FLAG-PCR(引物N端添加FLAG)，这些技术通过添加修饰碱基、特定的酶或者附加的程序，提高检测的灵敏性；一些新的先进技术也已经出现，如平行测序或集束技术这些则需要非常专业的知识和特殊精密复杂的仪器设备。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种荧光定量PCR检测突变型cfDNA或其含有突变位点的部分片段的成套引物。本专利技术提供的成套引物，包括扩增突变型靶序列的特异性引物和阻断序列；所述突变型靶序列为所述突变型cfDNA含有突变位点的区域；所述扩增突变型靶序列的特异性引物由突变型上游引物和突变型下游引物组成；所述突变型上游引物和所述突变型下游引物均与所述突变型靶序列结合，且所述突变型下游引物的3’末端最后一个碱基与所述突变型靶序列中位于所述突变位点的突变碱基互补；所述阻断序列与野生型靶序列中含有野生型碱基片段互补，所述野生型靶序列为所述突变型靶序列核苷酸序列中位于所述突变位点的突变碱基恢复为野生型碱基，使该突变位点变为野生型位点，其余核苷酸不变，得到的序列；所述阻断序列的3’端封闭标记；所述突变型cfDNA为与野生型cfDNA相比存在突变碱基的cfDNA。上述成套引物中，所述试剂盒还包括用于扩增野生型靶序列的特异性引物，所述用于扩增野生型靶序列的特异性引物由野生型上游引物和野生型下游引物组成；所述野生型上游引物与所述突变型上游引物相同；所述野生型下游引物为将所述突变型下游引物的3’末端最后一个碱基替换为所述野生型靶序列中位于所述野生型位点的野生型碱基的互补碱基，其余核苷酸不变，得到的引物。上述成套引物中，所述突变型靶序列和所述野生型靶序列的大小均为60-100bp；或所述突变位点不位于所述突变型靶序列的两端或位于所述突变型靶序列的中部；或所述突变位点位于所述突变型靶序列从5‘端起30-50bp的区域内；或所述野生型靶序列中含有野生型碱基片段大小为15-25nt；或所述野生型碱基的互补碱基不位于所述阻断序列的两端或位于所述阻断序列的中部；或所述野生型碱基的互补碱基位于所述阻断序列从5‘端起6-15bp的区域内；或所述各个引物大小均为20-30nt；或所述阻断序列的大小为15-25nt。上述成套引物中，所述突变型上游引物、所述突变型下游引物和所述阻断序列的摩尔比为1:1：1；或所述突变型上游引物和所述突变型下游引物的摩尔比为1:1。上述成套引物中，所述cfDNA或其含有突变位点的部分片段为血液循环肿瘤DNA或其含有突变位点的部分片段；所述血液循环肿瘤DNA或其含有突变位点的部分片段为K-ras基因或K-ras基因含有突变位点的部分片段；所述K-ras基因含有突变位点的的核苷酸序列为序列1；K-ras突变型靶序列的核苷酸序列为序列1；K-ras突变位点为序列1第49位；K-ras突变型上游引物的核苷酸序列为序列2；K-ras突变型下游引物的核苷酸序列为序列3；K-ras野生型靶序列为序列1的第49位的突变碱基A恢复为野生型碱基G，其余核苷酸不变，得到的序列；K-ras野生型靶序列中含有野生型碱基片段为所述K-ras野生型靶序列第40－56位核苷酸；所述阻断序列的核苷酸序列为序列4；K-ras野生型上游引物的核苷酸序列均为序列2；K-ras野生型下游引物为序列5。本专利技术另一个目的是提供一种荧光定量PCR检测突变型cfDNA的PCR试剂。本专利技术提供的PCR试剂，包括A或A+B，所述A包括上述成套引物中的所述扩增突变型靶序列的特异性引物、所述阻断序列和含有DNA聚合酶的PCR缓冲液；所述B包括上述成套引物中的所述扩增野生型靶序列的特异性引物和含有DNA聚合酶的PCR缓冲液；所述扩增突变型靶序列的特异性引物中各条引物在所述A中的浓度均为3pmol/ml；所述扩增野生型靶序列的特异性引物中各条引物在所述B中的浓度均为3pmol/ml；所述阻断序列在所述A中的浓度均为3pmol/ml。含有上述成套引物或上述试剂的试剂盒也是本专利技术保护的范围。上述成套引物或上述试剂的试剂盒或上述的试剂盒在制备检测突变型cfDNA产品中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述成套引物或上述试剂的试剂盒或上述的试剂盒在制备检测突变型cfDNA产品中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术第3个目的是提供一种检测待测样品中突变型cfDNA或其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光定量PCR检测突变型cfDNA或其含有突变位点的部分片段的成套引物，包括扩增突变型靶序列的特异性引物和阻断序列；所述突变型靶序列为所述突变型cfDNA含有突变位点的区域；所述扩增突变型靶序列的特异性引物由突变型上游引物和突变型下游引物组成；所述突变型上游引物和所述突变型下游引物均与所述突变型靶序列结合，且所述突变型下游引物的3’末端最后一个碱基与所述突变型靶序列中位于所述突变位点的突变碱基互补；所述阻断序列与野生型靶序列中含有野生型碱基片段互补，所述野生型靶序列为所述突变型靶序列核苷酸序列中位于所述突变位点的突变碱基恢复为野生型碱基，使该突变位点变为野生型位点，其余核苷酸不变，得到的序列；所述阻断序列的3’端封闭标记；所述突变型cfDNA为与野生型cfDNA相比存在突变碱基的cfDNA。

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR检测突变型cfDNA或其含有突变位点的部分片段的成套引物，包括扩增突变型靶序列的特异性引物和阻断序列；所述突变型靶序列为所述突变型cfDNA含有突变位点的区域；所述扩增突变型靶序列的特异性引物由突变型上游引物和突变型下游引物组成；所述突变型上游引物和所述突变型下游引物均与所述突变型靶序列结合，且所述突变型下游引物的3’末端最后一个碱基与所述突变型靶序列中位于所述突变位点的突变碱基互补；所述阻断序列与野生型靶序列中含有野生型碱基片段互补，所述野生型靶序列为所述突变型靶序列核苷酸序列中位于所述突变位点的突变碱基恢复为野生型碱基，使该突变位点变为野生型位点，其余核苷酸不变，得到的序列；所述阻断序列的3’端封闭标记；所述突变型cfDNA为与野生型cfDNA相比存在突变碱基的cfDNA。2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增野生型靶序列的特异性引物，所述用于扩增野生型靶序列的特异性引物由野生型上游引物和野生型下游引物组成；所述野生型上游引物与所述突变型上游引物相同；所述野生型下游引物为将所述突变型下游引物的3’末端最后一个碱基替换为所述野生型靶序列中位于所述野生型位点的野生型碱基的互补碱基，其余核苷酸不变，得到的引物。3.根据权利要求1或2所述的成套引物，其特征在于：所述突变型靶序列和所述野生型靶序列的大小均为60-100bp；或所述突变位点不位于所述突变型靶序列的两端或位于所述突变型靶序列的中部；或所述突变位点位于所述突变型靶序列从5‘端起30-50bp的区域内；或所述野生型靶序列中含有野生型碱基片段大小为15-25nt；或所述野生型碱基的互补碱基不位于所述阻断序列的两端或位于所述阻断序列的中部；或所述野生型碱基的互补碱基位于所述阻断序列从5‘端起6-15bp的区域内；或所述各个引物大小均为20-30nt；或所述阻断序列的大小为15-25nt。4.根据权利要求1-3中任一所述的成套引物，其特征在于：所述突变型上游引物、所述突变型下游引物和所述阻断序列的摩尔比为1:1：1；或所述突变型上游引物和所述突变型下游引物的摩尔比为1:1。5.根据权利要求1-4中任一所述的成套引物，其特征在于：所述cfDNA或其含有突变位点的部分片段为血液循环肿瘤DNA或其含有突变位点的部分片段；所述血液循环肿瘤DNA或其含有突变位点的部分片段为K-ras基因或K-ras基因含有突变位点的部分片段；所述K-ras基因含有突变位点的的核苷酸序列为序列1；K-ras突变型靶序列的核苷酸序列为序列1；K-ras突变位点为序列1第49位；K-ras突变型上游引物的核苷酸序列为序列2；K-ras突变型下游引物的核苷酸序列为序列3；K-ras野生型靶序列为序列1的第49位的突变碱基A恢复为野生型碱基G，其余核苷酸不变，得到的序列；K-ras野生型靶序列中含有野生型碱基片段为所述K-ras野生型靶序列第40－56位核苷酸；所述阻断序列的核苷酸序列为序列4；K-ras野生型上游引物的核苷酸序列均为序列2；K-ras野生型下游引物为序列5。6.一种荧光定量PCR检测突变型cfDNA的PCR试剂，包括A或A+B，所述A包括权利要求1-5中任一所述成套引物中的所述扩增突变型靶序列的特异性引物、所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗保君，
申请(专利权)人：罗保君，
类型：发明
国别省市：北京,11