紫甘蓝内参基因、引物对及用途制造技术

本发明专利技术公开了一种紫甘蓝内参基因，碱基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术公开了紫甘蓝内参基因扩增引物对，扩增引物对为：如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列。本发明专利技术公开了紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对，实时荧光定量引物对为：如SEQ ID NO：4和5所示的碱基序列。本发明专利技术公开了一种用于紫甘蓝功能基因相对表达水平检测的试剂盒，其包含实时荧光定量引物对。本发明专利技术公开了内参基因或实时荧光定量引物对于紫甘蓝功能基因在紫甘蓝不同发育时期以及紫甘蓝不同品种中相对表达水平检测方面的用途。本发明专利技术解决了现有紫甘蓝定量PCR检测中没有内参基因的现状，提高了采用实时荧光定量PCR技术检测紫甘蓝中基因表达分析的稳定性和可靠性。

Purple cabbage, and use of reference gene primers

The invention discloses a purple cabbage reference gene, the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1. The invention discloses a purple cabbage reference gene amplification primers, primers for SEQ sequence: such as NO:2 and ID shown in figure 3. The invention discloses a purple cabbage reference gene by real-time fluorescence quantitative real-time fluorescence quantitative primers, primer: the nucleotide sequence of SEQ ID NO:4 and shown in figure 5. The present invention discloses a kit for detecting relative expression level of functional genes in purple cabbage, which includes real-time fluorescent quantitative primer pairs. The invention discloses a reference gene or real-time quantitative primer for functional genes in purple cabbage cabbage at different developmental stages and different varieties of purple cabbage in the use of the relative expression level detection. The invention solves the situation of no existing reference genes of purple cabbage and quantitative detection of PCR, improve the real-time PCR to detect the gene expression of purple cabbage in the analysis of stability and reliability.

【技术实现步骤摘要】
紫甘蓝内参基因、引物对及用途
本专利技术属于分子生物学
，涉及紫甘蓝内参基因、引物对及用途，特别涉及紫甘蓝内参基因18SrRNA的序列、克隆方法及其作为内参基因的扩增引物和其在RT-qPCR中的应用。
技术介绍
紫甘蓝(BrassicaoleraceaL.var.capitataf.rubraDC.)为十字花科芸薹属，甘蓝变种。紫甘蓝的营养丰富，尤以丰富的维生素C、较多的维生素E、维生素B，以及丰富的花青素甙、矿物质和纤维素等，备受人们的欢迎。紫甘蓝的主要营养成分与结球甘蓝差不多，但含有的维生素成分及矿物质都高于结球甘蓝，并且含有大量天然色素，故公认紫甘蓝的营养价值高于结球甘蓝。此外，紫甘蓝不仅营养丰富，而且结球紧实，色泽艳丽，抗寒。耐热，产量高，耐贮运，是很受欢迎的一种蔬菜。紫甘蓝在欧洲地区主要作为色拉菜或西餐配色用，随着改革开放的逐步深入，特别是国际交往的日益频繁，我国对紫甘蓝的需要量也日渐增多，众多大城市近郊菜区已把紫甘蓝列为花色蔬菜而种植。紫甘蓝在工业、科研、医药、食品加工等行业中的应用逐渐受到重视，其分子生物学的研究也不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示紫甘蓝基因表达和调控的机理。实时荧光定量PCR(qPCR)是目前研究基因定量表达的主要方法。为了避免不同样本的RNA质量、产量、逆转录效率以及扩增效率上存在差异，在做基因表达分析时，通常会引入看家基因(ACT、18SrRNA、GAPDH、UBQTUA、TUB和EF-1α等)作为内参基因进行数据校正从而减少样本之间的误差。根据特定实验材料及条件选择合适qPCR分析的内参基因，对于准确校正目的基因的表达至关重要。理想的内参基因在不同组织类型、生长阶段及不同实验条件下，其表达水应该平均保持一致。一般来讲，常选择稳定表达的看家基因作为内参基因。然而，近来研究表明，任一看家基因的稳定表达只是在一定范围内的相对稳定，若不加筛选就盲目以一种看家基因作为任何实验条件下的内参，会导致结果精确度低甚至错误。因此，在利用qPCR进行基因表达分析时，应该根据特定实验材料和条件选择合适的内参基因。但是，目前紫甘蓝的分子生物学研究还在起步阶段。关于紫甘蓝的内参基因的研究还未见报道。目前也未发现实时荧光定量PCR技术应用于紫甘蓝中基因表达水平的研究。缺乏内参基因，难以实现对基因表达水平的校正和标准化，也不能对基因在不同条件和发育时期下的表达水平进行研究和比较，大大阻碍了紫甘蓝中各种基因的表达特性研究和基因功能分析研究。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种紫甘蓝内参基因。本专利技术另有一个目的是提供一种紫甘蓝内参基因扩增引物对。本专利技术还有一个目的是提供一种紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对。本专利技术另有一个目的是提供一种用于紫甘蓝功能基因相对表达水平检测的试剂盒。本专利技术还有一个目的是提供内参基因或实时荧光定量引物对于紫甘蓝功能基因在紫甘蓝不同发育时期以及紫甘蓝不同品种中相对表达水平检测方面的用途。为此，本专利技术提供的技术方案为：一种紫甘蓝内参基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。紫甘蓝内参基因扩增引物对，所述扩增引物对为：如SEQIDNO：2所示的碱基序列和如SEQIDNO：3所示的碱基序列。紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对，所述实时荧光定量引物对为：如SEQIDNO：4所示的碱基序列和如SEQIDNO：5所示的碱基序列。一种用于紫甘蓝功能基因相对表达水平检测的试剂盒，其包含所述的引物对。所述的内参基因或所述的实时荧光定量引物对于紫甘蓝功能基因在紫甘蓝不同发育时期以及紫甘蓝不同品种中相对表达水平检测方面的用途。本专利技术不仅解决了现有紫甘蓝定量PCR检测中没有内参基因的现状；而且所涉及的引物特异性强，大大提高了采用实时荧光定量PCR技术检测紫甘蓝中基因表达分析的稳定性和可靠性。本专利技术至少包括以下有益效果：1.本专利技术首次克隆得到紫甘蓝的18SrRNA基因片段；2.本专利技术首次提出在紫甘蓝定量PCR检测中建立通用的内参基因；3.本专利技术首次提出将紫甘蓝18SrRNA基因作为内参基因用于紫甘蓝在不同品种和不同发育时期的定量PCR检测，解决了紫甘蓝定量PCR检测中没有内参基因的现状；4.本专利技术提出的检测引物对具有特异性，优化了PCR扩增程序，大大提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度以及紫甘蓝基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1是本专利技术实施例2中的1％琼脂糖电泳图；图2是本专利技术实施例2中实时荧光定量PCR扩增曲线图；图3是本专利技术实施例2中实时荧光定量PCR溶解曲线图；图4是本专利技术实施例3中实时荧光定量PCR扩增曲线图；图5是本专利技术实施例3中的2％琼脂糖电泳图；图6是本专利技术实施例4中实时荧光定量PCR扩增曲线图；图7是本专利技术实施例5中实时荧光定量PCR扩增曲线图；图8是本专利技术实施例6中实时荧光定量PCR扩增曲线图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本专利技术提供一种紫甘蓝内参基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。该内参基因为18SrRNA基因。本专利技术还提供一种紫甘蓝内参基因扩增引物对，所述扩增引物对为：如SEQIDNO：2所示的碱基序列和如SEQIDNO：3所示的碱基序列。紫甘蓝18SrRNA基因的核苷酸序列的克隆方法，提取紫甘蓝总RNA，采用oligod(T)反转录并作为产物第一链cDNA为模板，利用引物对18SrRNA-F(SEQIDNO：2)和18SrRNA-R(SEQIDNO：3)进行PCR扩增，筛选得到阳性克隆，最后经测序验证。所述PCR的扩增反应条件如下：94℃预变性3min，【98℃变性10s、54℃退火30s、68℃延伸1min】30个循环，68℃再延伸5min。本专利技术还提供一种紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对，所述实时荧光定量引物对为：如SEQIDNO：4所示的碱基序列和如SEQIDNO：5所示的碱基序列。本专利技术还提供一种qPCR扩增18SrRNA基因部分序列的方法，提取紫甘蓝的总RNA，利用DNaseI去除gDNA后，以oligod(T)为引物进行反转录，然后以产物第一链cDNA为模板进行荧光定量PCR反应。荧光染料为SYBGGreenI。所述荧光定量PCR扩增的方法采用三步法，即在95℃预变性15min，运行40个循环的95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，再运行溶解曲线阶段的95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s的分析。本专利技术克隆了紫甘蓝中18SrRNA的基因片段。设计了相应的特异性基因定量引物，建立了基于SYBGGreenI染料技术的RealtimePCR方法，从而为紫甘蓝中基因表达水平分析提供了有用的方法。本专利技术还提供一种用于紫甘蓝功能基因相对表达水平检测的试剂盒，其包含所述的实时荧光定量引物对。本专利技术还提供一种所述的内参本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种紫甘蓝内参基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种紫甘蓝内参基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。2.紫甘蓝内参基因扩增引物对，所述扩增引物对为：如SEQIDNO：2所示的碱基序列和如SEQIDNO：3所示的碱基序列。3.紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对，所述实时荧光定量引物对为：如SEQIDNO：4所示的碱基序...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志东，吴杰，张洁，王丽金，孙倩倩，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11