一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用制造技术

本发明专利技术提供一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用，该引物组合物包括正向引物F、反向引物R、SNP特异引物1和SNP特异引物2；正向引物F和反向引物R用于扩增基因中共有保守序列，正向引物F和SNP特异性引物1用于扩增等位基因1特异性序列，正向引物F和SNP特异性引物2用于扩增基因2特异序列；SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一为5’端增加了GC尾巴的修饰的SNP特异引物。本发明专利技术引物组合物应用于基于HRM检侧基因多态性时，其扩增出两个特异性片段，增加了各扩增产物Tm之间的差异，有效排除了假阳性结果，从而提高了结果的特异性和可靠性。

Application of primer combination based on HRM for detecting gene polymorphism

The present invention provides a composition using primer HRM detection gene polymorphism based on the primer composition including forward primer F, reverse primer R, SNP specific primers and 1 SNP primers and 2 F primers; forward and reverse primers used to amplify the R gene conserved sequence, positive primer F and SNP specific primers 1 for amplification of the 1 allele specific sequence of the forward primer F and SNP specific primers for amplification of specific sequences of 2 genes in 2 SNP and 1 SNP primers; 2 specific primers was one of the 5 'end of increased SNP specific primers of modified GC tail. The invention is applied to HRM detection primer composition based on genetic polymorphism, which amplified two specific fragments, increase the amplification product difference between Tm, effectively eliminate the false positive results, so as to improve the specificity and reliability of the results.

【技术实现步骤摘要】
一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用
本专利技术涉及一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用，属于基因多态性(SNPs)检测领域。
技术介绍
单核苷酸多态性即SNPs是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、G、C、T)替换而引起的多态性，是新一代多态性遗传标记。SNPs在生物基因组中广泛存在，如人类30亿个碱基中每千个碱基出现一次，在整个基因组共有300万以上的SNPs。SNPs在人类疾病研究，尤其是精准医疗、肿瘤和遗传病的早期检测、胎儿遗传病筛查中具有重要应用价值。现在已知许多遗传病跟特定的基因位点变异有关，还有些药物的治疗效果跟个体的特定基因SNP型相关，例如氯吡格雷的治疗效果就与个体的特定基因SNP型相关，现有技术表明药物代谢酶的基因多态性是影响氯吡格雷疗效的主要因素，其是近年来精准医疗的热点。根据相关文献报道，CYP2C19*2的SNP型与氯吡格雷的治疗效果相关。CYP2C19*2基因型是CYP2C19基因的第5外显子在第681位的突变(681G/A)，可造成外显子5'端40bp碱基缺失，并改变之后的mRNA阅读框架，产生出一个无功能的蛋白(CYP2C19*2酶)。鉴于SNPs的重要应用价值，目前已开发多种方法用于SNPs的检测，主要有以下几种：(1)限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)，该方法利用限制性内切酶对PCR片段进行酶切，通过电泳区分片段，根据电泳结果区分是否存在SNP。(2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)，该方法利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA片段分开。(3)测序法，对SNP所在DNA区段进行直接测序比较，即可明确不同材料SNP类型。然而，上述电泳及其他常见的核酸变异分析技术需要复杂的处理，无法真正实现闭管操作，容易引起污染导致假阳性检测，难以实现批量自动化分析。HRM技术是在定量PCR的基础上发展起来的后PCR分析方法，通过监测双链DNA熔解曲线的变化来区分DNA变异，其分辨率最高可以区分单碱基差异。扩增和分析都是在封闭的体系内自动完成，而且一次可以进行384个反应，有望克服上述现有检测SNPs技术的缺陷。然而，由于SNP差异引起的Tm值很小，该差异值仅略高于高精度仪器的分辨率，实验误差稍微高一点，就无法稳定地区分不同基因型，具体而言，单个碱基差异的双链DNA的熔解温度(Tm值)差异通常只有0.1～0.5℃，虽然仪器的温度分辨率能达到0.1℃，但是实际上由于重复性等因素影响，相同样品间的Tm值误差也在0.1～0.3℃，导致实验的稳定性差，结果可信度低。因此，HRM技术的以上缺陷严重限制了其在检测SNP中的应用。因此，本领域亟需开发一种稳定性高，结果可信度高，简单方便，检测样品规模大的检测SNP的技术。
技术实现思路
有鉴于本领域对SNP检测的迫切需要，本专利技术的目的之一在于提供引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用，该引物组合物能够应用于HRM，高效可靠的检测SNP。为此，本专利技术提供一种引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用；所述引物组合物包括正向引物F、反向引物R、SNP特异引物1和SNP特异引物2；所述正向引物F和所述反向引物R用于扩增基因中共有保守序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物1用于扩增等位基因1特异性序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物2用于扩增等位基因2特异序列；SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一为5’端增加了GC尾巴的修饰的SNP特异引物。本专利技术中所述系统也可以称为一种“套组”或“套件”，其中包括了本专利技术中引物组合物或含其的试剂盒，亦可包括其他试剂、材料及仪器设备等组件，作为一种产品例如试剂套件的形式，各组件可按照预定的位置在大包装中分别放置或是独立包装后成套销售及使用。本专利技术所述修饰的SNP特异引物是指在正常设计的SNP特异引物上进行修饰。本专利技术通过实验证明通过在SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一的5’端增加GC尾巴，即单个SNP特异引物加GC尾巴，能够显著改变不同SNP型特异扩增产物的Tm。采用这种方式在不影响特异性的情况下，能使不同SNP型特异扩增产物的Tm相差高达2℃以上，该方式有效克服了HRM技术应用于检测SNP中的瓶颈。优选地，所述GC尾巴的长度为3～7。所述GC尾巴是指仅含G和C碱基的序列。此外，本专利技术实验结果证明，本专利技术引物组合物能够有效的排除假阳性结果，显著提高了结果的可信度，其正确率可达100％。作为本专利技术前述应用的一具体实施方式，所述基于HRM检测基因多态性可包括如下步骤：(1)将待检DNA样品、所述引物组合物、PCR扩增反应液及与双链DNA结合的荧光染料混合；(2)对步骤(1)所得混合物实施PCR扩增；(3)对步骤(2)所得PCR扩增产物进行HRM分析，判断待检测样品的SNP类型。作为本专利技术前述应用的一具体实施方式，步骤(3)中HRM分析的温度范围为65～90℃，升温速度为0.02℃/sec。作为本专利技术前述应用的一具体实施方式，步骤(2)中PCR扩增条件为：95℃/10sec，62℃/10sec，72℃/10sec，进行35～45个循环。本专利技术所述的引用组合物可应用于检测基因CYP2C19*2的SNP型。在这种情况下，优选地，在基于HRM检测CYP2C19*2基因多态性的引物组合物中：所述正向引物F为TTTTCCCACTATCATTGATTATTTCC(SEQIDNO:1)；所述反向引物R为GTCCCGAGGGTTGTTGAT(SEQIDNO:2)；所述SNP特异引物1为GGCGGCGTAATTTGTTATGGGTTCCT(SEQIDNO:3)；所述SNP特异引物2为TTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCC(SEQIDNO:4)。优选地，所述正向引物、所述SNP特异引物1、所述SNP特异引物2与所述反向引物R的摩尔比为1～5：0.5～2：0.5～2：0.5～2。作为本专利技术前述应用的一具体实施方式，所述试剂盒还包括与双链DNA结合的荧光染料。优选地，所述荧光染料为LCGreen或EvaGreen。作为本专利技术前述应用的一具体实施方式，所述试剂盒还可包括dNTP、缓冲液和聚合酶中的一种或多种。本专利技术所述引物组合物应用于基于HRM检侧基因多态性时，其扩增出两个特异性片段，增加了各扩增产物Tm之间的差异，有效排除了假阳性结果，从而提高了结果的特异性和可靠性。此外，本专利技术仅需使用普通、通用型PCR扩增方法和试剂，其通用性好、成本低，并且不需要对引物进行荧光修饰，研发和生产成本低，方法简便，能够一次分析数百个样品。综上可知，本专利技术提供了前述引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用。所述引物组合物是在单个SNP特异引物加GC尾巴，其能够显著改变不同SNP型特异扩增产物的Tm，有效克服了HRM技术应用于检测SNP中的瓶颈，具有重大的价值及广阔的市场前景。附图说明图1为本专利技术实施例1引物组合物扩增出的产物的HRM分析结果图。图2为本专利技术对比例1引物组合物扩增出的产物的HRM分析结果图。图3为本专利技术对比例2引物组合物扩增出的产物的HRM分析结果图。图4为图3的局部放大图本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用；所述引物组合物包括正向引物F、反向引物R、SNP特异引物1和SNP特异引物2；所述正向引物F和所述反向引物R用于扩增基因中共有保守序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物1用于扩增等位基因1特异性序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物2用于扩增等位基因2特异序列；SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一为5’端增加了GC尾巴的修饰的SNP特异引物。

【技术特征摘要】
1.引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用；所述引物组合物包括正向引物F、反向引物R、SNP特异引物1和SNP特异引物2；所述正向引物F和所述反向引物R用于扩增基因中共有保守序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物1用于扩增等位基因1特异性序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物2用于扩增等位基因2特异序列；SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一为5’端增加了GC尾巴的修饰的SNP特异引物。2.根据权利要求1所述的的应用，其中，所述基于HRM检测基因多态性包括如下步骤：(1)将待检DNA样品、所述引物组合物、PCR扩增反应液及与双链DNA结合的荧光染料混合；(2)对步骤(1)所得混合物实施PCR扩增；(3)对步骤(2)所得PCR扩增产物进行HRM分析，判断待检测样品的SNP类型。3.根据权利要求2所述的应用，其中，步骤(3)中HRM分析的温度范围为65～90℃，升温速度为0.02℃/sec。4.根据权利要求2所述的应用，其中，步骤(2)中PCR扩增条件为：95℃/10sec，6...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖翔，李洪波，
申请(专利权)人：北京美莱博医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11