一种基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了SPEXIN基因及其表达产物可作为结直肠癌早期辅助诊断的分子标志物。本发明专利技术提供了一种用于检测个体受试者组织和/或血液中SPEXIN基因水平的诊断试剂盒。本发明专利技术进一步公开了检测个体受试者SPEXIN基因水平的具体操作方法。本发的实验表明SPEXIN基因表达水平在癌组织和正常组织中存在显著差异，即通过检测受试者组织和/或血液中SPEXIN基因的水平即可初步判断该受试者是否患有结直肠癌和/或预后状况。本发明专利技术方法简单、操作方便，检测得到的基因表达水平可以辅助诊断受试个体患有结直肠癌的可能性以及结直肠癌患者预后判断的指标，为结直肠癌药物的开发和结直肠癌患者的诊治提供新思路。

A SPEXIN based kit for diagnosis and / or prognosis of colorectal cancer and its application

The present invention discloses the SPEXIN gene and its expression product, which can be used as the molecular marker for early diagnosis of colorectal cancer. The present invention provides a diagnostic kit for detecting SPEXIN gene levels in individual subjects and / or blood. The present invention further discloses the specific operation method for detecting the SPEXIN gene level of individual subjects. The experimental results show that there are significant differences in the level of cancer and normal tissue expression of SPEXIN gene, which can be detected by the level of the subjects by tissue and / or blood SPEXIN gene in the preliminary judgment of the subjects suffering from colorectal cancer and / or prognosis. The method of the invention has simple and convenient operation, the expression level was detected by gene diagnosis by the likelihood of an individual suffering from colorectal cancer and colorectal cancer prognostic indicators, to provide new ideas for the diagnosis and treatment of colorectal cancer drug development and colorectal cancer patients.

【技术实现步骤摘要】
一种基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒及应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学
，具体涉及一种基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒及应用。
技术介绍
结直肠癌（colorectalcancer，CRC）是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。世界流行病学调查表明，结直肠癌在各类恶性肿瘤中的发病率居第3位。随着经济发展和人民生活水平的提高，生活方式和饮食结构的改变，在我国其发病率在各种居恶性肿瘤仅次于肺癌及乳腺癌居第3位，死亡率居第4位。而且据预测，我国结直肠癌的发病率和死亡率在今后相当长一段时间内将呈稳步上升趋势，成为我国最常见、高发病率的恶性肿瘤之一，已经成为严重威胁人民的健康。结直肠癌的发生与饮食环境遗传等密切相关，是多种因素共同作用的结果，结肠癌的防治研究已不断引起人们的重视。由于结直肠癌临床前期无症状，且持续时间较长，因此对结直肠癌的早期诊断和筛查并及时进行治疗，有助于降低结直肠癌的发病率及死亡率。肿瘤分子标志物是指肿瘤细胞在癌变过程中由于基因表达的增加或降低导致其含量改变的一些蛋白或生物活性物质，可用于肿瘤诊断，检测肿瘤过程以及患者愈后评定，它对肿瘤的临床治疗产生了很大的影响。所以寻找较高灵敏性和特异性的肿瘤分子标志物，对结直肠癌的诊断是十分有必要的。通过寻找新的结直肠癌标志基因，对预测结直肠癌的发生发展治疗效果有一定的临床指导意义。目前，基因诊断技术的建立和发展为结直肠癌的早期辅助诊断和预后判断提供了途径。SPEXIN蛋白最早是由Mirabeau团队基于隐马尔可夫模型（HMM）的生物信息学搜索策略首次鉴定发现。人SPEXIN基因（Ch12,orf39；～17,333bp）位于染色体12p12.1。SPEXIN基因和蛋白广泛在人类和啮齿类动物的中枢神经系统和外周组织都有分布。SPEXIN蛋白参与机体能量代谢、心血管、食欲等生理和病理功能的调节。然而，SPEXIN基因和/或蛋白对结直肠癌的作用迄今尚未见报道。目前临床上常用的用于结直肠癌早期诊断的标志物在特异性和灵敏度方面尚存在一些不足。随着对癌症发生发展过程中分析信号的阐明，新的肿瘤标志物可能会出现。分子生物学的不断发展以及基因工程技术的不断进步，寻找和利用新的且敏感度高的标志基因，可有效地进行分子水平的检测和诊断，进而为这些疾病的早期诊治和预防提供有利条件。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒，该试剂盒能特异检测出SPEXIN基因的表达有无下调，从而作为结直肠癌的诊断依据。该试剂盒检测灵敏度高、特异性强。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒，所述试剂盒包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ；所述引物对Ⅰ的正向序列如SEQIDNO：1所示（cacagagcctcgcctttgc），反向序列如SEQIDNO：2所示（ccaccatcacgccctgg）；所述引物对Ⅱ的正向序列如SEQIDNO：3所示（tccgcagagactgttggaga），反向序列如SEQIDNO：4所示（gttgctgcctccggaatagt）。所述的基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒，还包括试剂Ⅰ、试剂Ⅱ和溶液组，溶液组包括溶液a-i,试剂Ⅰ、试剂Ⅱ及溶液a-i的组成如下：。所述的基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒的应用，其特征在于包含如下操作步骤：（1）从受试者的血液或结直肠组织提取总RNA；（2）检测样本和对照中SPEXIN的表达水平；（3）分别对样本和对照中SPEXIN的水平进行分析评估。所述步骤（1）中结直肠组织为结直肠癌组织或癌旁组织。所述步骤（2）为：将步骤（1）提取的总RNA反转录成的cDNA作为模板，以引物对Ⅰ为模板的检测结果作为内参基因表达量、以引物对Ⅱ为模板时的检测结果作为目的基因SPEXIN表达量。所述步骤（2）中SPEXIN的表达水平是指SPEXIN基因、SPEXIN多肽、SPEXIN蛋白质、SPEXIN多肽的结构衍生物或SPEXIN蛋白的功能类似物的水平。所述SPEXIN多肽或SPEXIN蛋白质均含有如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列（MKGLRSLAATTLALFLVFVFLGNSSCAPQRLLERRNWTPQAMLYLKGAQGRRFISDQSRRKDLSDRPLPERRSPNPQLLTIPEAATILLASLQKSPEDEEKNFDQTRFLEDSLLNW）。本专利技术的优点及有益效果在于：（1）本专利技术首次公开了SPEXIN与结直肠癌的相关性，可为以SPEXIN为基础的诊断试剂盒的制备提供依据；（2）本专利技术提供的诊断试剂盒可以通过检测基因表达状况来评估受试者含有患有结直肠癌的可能性，使用该试剂盒使检测更加灵敏和便捷，有利于结直肠癌的早期诊断和预后判断。附图说明图1为结直肠癌组与正常组SPXIN基因表达量的统计结果图；图2为结直肠癌患者SPXIN基因表达量与性别和年龄的关系图。具体实施方式本专利技术将在下面的实施例中进一步对本专利技术做进一步说明和阐述，但本专利技术并不局限于这些实施例。在以下实施例中所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所涉及到的试剂和材料等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒的制备根据SPEXIN基因的表达丰度与结直肠癌的相关性，可以通过检测SPEXIN基因的表达水平作为结直肠癌诊断的辅助指标。基于此，本专利技术提供了一种基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒，该诊断试剂盒的主要组分包括：扩增SPEXIN基因和beta-actin基因的（探针）引物对、SYBRGreenPCR反应体系，半定量PCR体系。扩增beta-actin基因引物对：正向引物序列，如SEQNO：1所示；反向引物序列，如SEQNO：2所示；扩增产物的长度为434bp。扩增SPEXIN基因引物对：正向引物序列，如SEQNO：3所示；反向引物序列，如SEQNO：4所示；扩增产物的长度为306bp。还包含溶液组（溶液a至i）和试剂Ⅰ、试剂Ⅱ，本试剂盒所包含的试剂及其含量如表1所示。表1.基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒组成。实施例1半定量PCR法检测结直肠癌组织SPEXINmRNA表达水平（1）组织标本的收集：收集河南大学淮河医院科2013-2016年间结直肠癌病人标本，癌组织及癌旁组织数对，分别置于1.5mL的RNase/DNase-free离心管中，经液氮桶转移至–80℃低温冰箱保存。（2）采用常规方法提取结直肠癌患者组织样本mRNA。[SambrookJ,萨姆布鲁克,RussellDW,etal.,分子克隆实验指南.2002:科学出版社.]，具体地：①取黄豆粒大小的组织块，放入相对应的EP管中，注意冰上操作，每管加入1.0mLTRIReagent，用超声破碎仪进行组织破碎，室温放置5min；②按照10:1的比例每管加入100μLBCP，盖好EP管管盖后剧烈涡旋混匀15s，在通风橱中室温放置8min；③4℃、12000g离心15min，离心结束后将上层约500μL的水相上清转移到新的标记清楚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ；所述引物对Ⅰ的正向序列如SEQ ID NO：1所示，反向序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物对Ⅱ的正向序列如SEQ ID NO：3所示，反向序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ；所述引物对Ⅰ的正向序列如SEQIDNO：1所示，反向序列如SEQIDNO：2所示；所述引物对Ⅱ的正向序列如SEQIDNO：3所示，反向序列如SEQIDNO：4所示。2.如权利要求2所述的基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒，其特征在于：还包括试剂Ⅰ、试剂Ⅱ和溶液组，溶液组包括溶液a-i,试剂Ⅰ、试剂Ⅱ及溶液a-i的组成如下：3.如权利要求1所述的基于SPEXIN的结直肠癌辅助诊断和/或预后判断试剂盒的应用，其特征在于包含如下操作步骤：(1)从受试者的血液或结直肠组织提取总RNA；(2)检测样本和对照中SPEXIN的表达水平；(3)分别对样...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫东，吕双瑜，王艳东，周云，聂小博，王群，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南,41