甜菜孢囊线虫的特异性SCAR标记以及快速SCAR‑PCR分子检测方法技术

本发明专利技术为“甜菜孢囊线虫的特异性SCAR标记以及快速SCAR‑PCR分子检测方法”，属植物线虫分子检测技术领域。甜菜孢囊线虫的特异性SCAR标记，具有如SEQ NO1所示的核苷酸序列。甜菜孢囊线虫快速SCAR‑PCR分子检测方法是基于甜菜孢囊线虫RAPD特异性区设计的一组甜菜孢囊线虫特异性引物HsSF和HsSR，能够特异性的从甜菜孢囊线虫中PCR扩增出长度为922bp的片段，该特异性引物和检测方法的检测阈值为1/256头二龄幼虫和10

Method for detection of specific SCAR marker of beet cyst nematode and SCAR PCR molecular

The invention relates to a detecting method for specific SCAR marker of beet cyst nematode and fast SCAR PCR molecule, which belongs to the technical field of plant nematode molecular detection. Specific SCAR marker of beet cyst nematode, has the nucleotide sequence of SEQ is shown in NO1. Detection method of beet cyst nematode SCAR PCR is fast molecular design of beet cyst nematode RAPD specific area of a group of beet cyst nematode specific primers HsSF and HsSR based on the specific from the beet cyst nematode PCR amplified 922bp fragment length, the detection threshold of the specific primers and detection methods for the first two and 10 instar larvae of 1/256

【技术实现步骤摘要】
甜菜孢囊线虫的特异性SCAR标记以及快速SCAR-PCR分子检测方法
本专利技术属植物线虫分子检测
，涉及甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记全序列、特异性SCAR标记引物序列和快速SCAR-PCR分子检测方法。技术背景甜菜孢囊线虫(HeteroderaschachtiiSchmidt)是全世界重要检疫性有害生物，对甜菜具有毁灭性危害(中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，中华人民共和国农业部第862号公告(2007-05-29))。1850年Schacht首次在德国报道(Franklin,M.T..Heteroderaschachtii.CIHDescriptionsofplantparasiticnematodes,Set1,No.1.StAlbans,UK,CommonwealthInstituteofHelminthology,1972:4.)。到目前为止已在全世界的美洲、欧洲、亚洲等50多个国家或地区有分布，22个国家将该线虫列为检疫对象(SteeleAE.Nematodeparasitesofsugarbeets[M]//NickleWR.Plantandinsectnematodes.NewYork:MarcelDekker,1984:507-569)。甜菜胞囊线虫是甜菜上危害最严重的病原生物之一，可导致甜菜产量损失25％-50％，严重侵染时损失更大。19世纪下半叶，欧洲因其严重危害，导致甜菜大幅减产，对欧洲甜菜生产造成毁灭性破坏许多糖厂倒闭。甜菜孢囊线虫寄主范围非常广泛，包括23个科95个属的218种植物，对甜菜、油菜和白菜、菠菜等农作物造成严重的经济损失(SteelAE.ThehostrangeofthesugarbeetnematodeHeteroderaschachtiiSchmidt[J].JournalofAmericanSocietyofSugarBeetTechnology.1965,13:1965,573-603.)。研究表明，当土壤中该线虫幼虫的群体密度达到每克土18条时，可使菠菜减产40％、甘蓝减产35％、大白菜减产24％。在欧洲每年的经济损失已经超过了9000万欧元，德国西部种植甜菜每年达44万hm2，其中每年约有1/4多的甜菜面积遭受该线虫危害，一般造成每公顷5～35t的产量损失，严重威胁着当地甜菜生产和制糖业(MüllerJ.TheeconomicimportanceofHeteroderaschachtiiinEurope[J].Helminthologia,1999,36:205–213)。甜菜孢囊线虫是我国重要进境检疫性有害生物(中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，2007)。随着经济全球化和我国一带一路战略的实施，人员交流和国际贸易的日益频繁，我国每年从甜菜孢囊线虫疫区国家进口大量的甜菜种子和加工原料，与我国新疆周边接壤的哈萨克斯坦、吉尔吉斯坦、乌兹别克斯坦等国家均有发生危害，该线虫随加工原料和进口种子的杂质传带传入我国的风险极高(彭德良，彭焕，刘慧.国外甜菜孢囊线虫发生危害、生物学和控制技术研究进展.植物保护,2015,41:1-7)。MAXENT与GARP两种生态位模型对甜菜孢囊线虫传入我国的适生区的预测结果表明，该线虫可在我国17个省市生存，我国内蒙古南部、新疆西部、河北中南部、山西东北部、宁夏、甘肃北部是该线虫入侵的高风险区(李建中，彭德良，刘淑艳.潜在外来入侵甜菜孢囊线虫在中国的适生性风险分析[J].植物保护,2008,34(5):90-94.)。目前我国的甜菜主要种植区域为内蒙古、新疆、甘肃等省市区，甜菜孢囊线虫暴发的风险极大。该线虫病害一旦传入我国，将对的我国甜菜生产构成了严重威胁，对该线虫做出快速准确的鉴定和诊断是当前兵团甜菜生产急需解决的关键问题之一。以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为植物线虫的快速诊断和检测提供了强有力的工具。特异性引物PCR分子检测技术在植物线虫的分子检测中取得了很大的发展，可以通过一次PCR测验即可检测出样本中的一个或多个植物线虫的种群，可以极大的缩短检测时间，提高检测效率。在植物线虫的快速分子检测中，RAPD是立足于PCR发展起来的一项分子标记技术。它以不同的基因组DNA为模板，以单一的随机寡聚核苷酸作引物，通过PCR反应，产生不连续的DNA产物。由于不同基因组DNA序列存在差异，其不同区段上可与引物同源互补的位点不同，扩增产物的数量、大小也不同，因而表现出多态性。RAPD标记具有效率高、样品用量少、灵敏度高、成本较低和检测容易等优点。但RAPD标记也有缺点：由于它所用的引物较短，并采用较低的退火温度，使其重复性差，易产生非特异性的条带；同时，RAPD为显性标记，无法区分个体是纯合的还是杂合的。解决的办法是将其转为SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregion)标记。SCAR标记是Paran等发展的一种新型分子标记(ParanI,MichelmoreRW.DevelopmentofreliablePCR-basedmarkerslinkedtodownymidewrisistencegenesinJettnce[J].TheorApplGenet,1993,85:985-993)，由RAPD技术衍生而来,代表一个在基因组遗传上确定的位点。通过对目的片段的克隆与测序,并对序列进行分析后设计出一对互补到原片段两端的碱基的引物,用此引物对原来的模板DNA进行扩增,特征序列扩增区域(SCARs)被特异扩增。这些特征序列扩增区域或维持原来片段的显性分离行为,或转换为共显性标记。该方法与RAPD相比具有如下优点：①由于使用较长的引物和高退火温度，因此具有高稳定性；②有可以将显性RAPD标记转化为共显性的SCAR标记的可能性。采用SCAR标记方法建立了松材线虫检测技术，克服了传统的形态鉴定需时长、鉴定难度大、存在错检或漏检以及不能对幼虫和雄虫进行鉴定等不足,实现了对松材线虫幼虫、雌雄成虫的任意大小片段均可进行定性鉴定的目标(陈凤毛，叶建仁，吴小芹等.松材线虫两种实用分子检测技术.北京林业大学学报.2011,33(4)：149-152)。Williamson[9]等通过对M.hapla和M.incognita全DNA的RAPD分析,筛选出具有M.hapla种鉴定特征的特异性扩增片段,经克隆、测序后,设计了一对20bp的特异性引物,准确鉴定了M.hapla(WilliamsonVM,Caswell-ChenE,WesterdahlB,etal.APCRassayidentifyanddistinguishsinglejuvenilesofM.haplaandM.incognita[J].JournalofNematology,1997,29:9～15)。Zijlstra等利用SCAR标记成功鉴定了南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫，而且所获得的标记能特异性鉴定各个龄期的根结线虫(CarolienZijlstra,DorineT.H.M.Donkers-VenneandMireilleFargette.IdentificationofMeloidogyn本文档来自技高网...

【技术保护点】
甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

【技术特征摘要】
1.甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2.根据上述特异性SCAR标记设计的一组特异性引物，分别为：HsSF:5’-GGACCCTGACGACCAGAATA-3’，HsSR:5’-GACAACACGAAGGAGCGAGC-3’。3.甜菜孢囊线虫快速SCAR-PCR分子检测方法，其特征在于：其PCR的反应体系中包含一组特异性引物为HsSF和HsSR，其核苷酸序列为：HsSF:5’-GGACCCTGACGACCAGAATA-3’，HsSR:5’-GACAACACGAAGGAGCGAGC-3’。4.根据权利要求3所述的检测方法，所述PCR的反应体系为含Mg2+的10×Buffer5μl，10mMdNTP4μl...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭焕，张瀛东，彭德良，李新，黄文坤，孔令安，冯晓东，赵守歧，刘慧，吴伟，张熠，高海峰，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11