本发明专利技术公开了一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体与应用，本发明专利技术通过RNA-seq测序技术并结合生物信息学分析，第一次获得了较为完整的禾谷孢囊线虫侵染抗性植物时候的基因表达谱，并在相关数据库中找到了三条具有致死效应的RNAi特异位点序列，其序列为：RCCNY1：SEQ ID NO.1或RCCNY2：SEQ ID NO.2或RCCNY3：SEQ ID NO.3。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，特别涉及一种用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用。
技术介绍
禾谷孢囊线虫又称燕麦孢囊线虫、禾谷孢囊线虫，对小麦、大麦、黑麦、燕麦及多种禾本科牧草具有严重危害性，是世界上广泛存在的病原线虫，尤其对小麦的生产构成严重的威胁。我国自1987年在湖北天门县发现该病害以来，迄今已在华北、西北、华中以及华东等13个省区市发现有分布，且有逐渐蔓延之势。目前的主要防治方法包括农业防治、化学农药防治和生物防治。长期以来我国农民主要采取轮作、灌溉、增施有机厩肥、深翻和日晒土壤、种植诱捕植物和调节播期等农业技术措施防治线虫,但是日常种植的作物基本上都是禾谷孢囊线虫的寄主,因而防治效果并不显著。化学农药防控线虫是有效的方法之一，但是它对环境和农产品造成的污染使得该方法缺陷凸显。而生物防治目前报道最多的是食线虫真菌和线虫天敌细菌,但因其效果不明显,商品化困难,至今尚没有一种生防制剂被广泛推广。因此,寻找安全而又行之有效的线虫防治途径非常必要。 RNAi干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA降解,使相应基因的表达关闭,从而引发的转录或转录后水平的基因沉默现象(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。这种现象是生物为保护自身基因组免受外源(如病毒)和内源性(如转座元件)序列的侵袭,特异性地调节或干扰基因表达的一种自身防御“免疫”应答现象。 关于线虫研究中,已发现线虫体内存在着能把RNAi信号放大和传递的机制，微量的dsRNA就能引导机体产生强烈的RNAi效应,而且能够传递到子代。dsRNA可以通过微注射进入C.elegans成虫,也可以把C.elegans成虫浸泡在含有dsRNA的溶液中或者喂饲含有dsRNA的大肠杆菌。注射进入的dsRNA很容易在干细胞中扩散引起RNAi,而且能将这种效应传递到子代。这种方法产生的表型外显率高,非常适合胚胎基因的功能研究。然而注射法需要体外合成dsRNA和手工注射操作,费时、花费高而且技术难度大,很难用于大规模的功能分析。浸泡法是将线虫浸泡于高浓度的dsRNA溶液。相比注射法,浸泡法能够同时对大量的线虫材料进行处理。但是,浸泡法同样需要体外合成大量的dsRNA(一般为1-5mg/ml),成本很高。与注射法和浸泡法比较，喂饲法有其独特的优势。喂饲法通过构建特殊载体,细菌体内诱导表达dsRNA,再喂饲线虫,可以有效抑制靶标基因的表达，省钱省事,并且可大规模进行实验。因而,如果建立一个RNAi细菌喂饲文库,该方法就可高效地研究大批基因的功能，从而找出可用于农业生产中线虫的防治方法。 禾谷孢囊线虫与根结线虫同属于固着性内寄生线虫，与寄主建立寄生关系后雌虫固着在取食部位不再移动。由于不能在人工培养基上培养,所以直接在寄生线虫中应用RNAi技术比较困难。根结线虫体形小,微注射感染手段变得不再实用。另外，它们在感染寄主植物前不正常吸收液体也使得研究无法开展。因而，近几年的一项重大突破即是找到在植物寄生线虫上进行RNAi技术的方法。首次向植物寄生线虫成功注入dsRNA的是Urwin等应用章鱼胺刺激大豆胞囊线虫(Heterodea glycines)和马铃薯白线虫(Globodera pallida)的口腔,使其吸半胱氨酸蛋白酶、hgctl、精子主蛋白(MSP)三个基因的dsRNA。处理过的线虫侵染植物14天后分离,发现三个靶标基因的表达明显受到抑制,相应的表观遗传性状也发生了改变。经优化后,此方法也被用于根结线虫的研究。Bakhetia等把M.incognita幼虫浸泡在编码过氧化物酶(dual oxidase)的dsRNA中，结果在线虫侵入大豆35天后检测,总产卵量减少了70％。Shingles等应用RNAi技术敲除Mi-cpl-1基因,降低了其转录本丰度，M.incognita的J2s幼虫的半胱氨酸蛋白酶活性也降低了。几丁质合成酶是甘蓝根结线虫(Meloidogyne artiellia)生成卵壳几丁质的一种重要的酶。Fanelli等证明把卵块浸泡在几丁质合成酶dsRNA溶液中,可以使几丁质合成酶基因的表达减少，卵孵化延迟。另外，Rosso等研究发现,间苯二酚可刺激M.incognita对dsRNA的吸收,并且观察到了明显的RANi现象。除了离体干扰线虫以外,有些学者通过构建表达dsRNA的转基因植物达到减少根结线虫寄生的目的。Yadav等把RNAi用于转基因烟草成功地干扰了M.incognita的生长发育，表明在寄主植物中表达dsRNA是一种控制寄生线虫病的可行策略。Huang等在拟南芥内过表达根结线虫寄生基因16D10，结果根结减少了63-90％,而且体积很小,卵块的产量也减少了69-93％，成功地减少了4种根结线虫的寄生。Fairbairn等构建转基因烟草(Nicotiana tabacum)表达dsRNA发夹结构，沉默爪哇根结线虫(Melododogyne javanica)转录因子MjTis11。结果虽然没有明显减少线虫的繁殖量和卵的孵化率,但是证明植物可以作为一种传输体系诱导根结线虫RNAi介导的基因沉默。由上可以看出,利用RNAi转基因植物来防治寄生线虫是一个新的防治策略，将为植病防治工作带来新的前景。 但前述研究均是集中在模式动物秀丽线虫和植物寄生根线虫的相关研究，由于禾谷孢囊线虫的基因组背景尚未阐明，所以没有相关研究报道。随着近年来转录组测序技术的发展，利用基因组和转录组技术相结合来研究植物寄生性线虫的方法流行起来。利用转录组技术可以高通量的获得相关线虫的候选基因从而进一步鉴定相关功能基因。我们利用对禾谷孢囊线虫(H.avenae)和根结线虫(Meloidogyne naasi)具有双抗作用的材料易变山羊草的根部进行了深度的转录组测序。通过对测序结果进行分析，在去除了植物，微生物，细菌和载体序列后，首次得到了禾谷孢囊线虫在侵染抗性植物时表达的相关基因846条。进一步和已有的线虫数据库进行比对分析后，去除和植物(plant)，昆虫(insect)和人类(human)同源的基因，最后得到三条和秀丽线虫(C.elegans)同源本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列，其特征在于，其序列为：RCCNY1：SEQ ID NO.1或RCCNY2：SEQ ID NO.2或RCCNY3：SEQ ID NO.3。
【技术特征摘要】
1.一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序
列，其特征在于，其序列为：RCCNY1：SEQ ID NO.1或RCCNY2：SEQ
ID NO.2或RCCNY3：SEQ ID NO.3。
2.根据权利要求1所述的一种用于线虫研究及生物防控的禾谷
孢囊线虫RNAi位点序列，其特征在于，所述干扰序列的构建方法为：
选用具有CCN抗性和RKN抗性的易变山羊草1号作为转录组测序
材料，之后通过RNA-seq测序技术得到了第一个禾谷孢囊线虫侵染植
物的转录组，进行转录组测序...
【专利技术属性】
技术研发人员：余懋群，郑明辉，李林，徐德林，龙海，潘志芬，邓光兵，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。