本发明专利技术公开了一种用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测的引物组合物及其应用。所述检测引物包括：HaF8：SEQ ID NO.3，HfF9：SEQ ID NO.4，HafF8：SEQ ID NO.5。本发明专利技术利用双重PCR技术，单次反应同步检禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫，降低了对上述两种病原的检测成本和工作量。本发明专利技术建立了一种特异性强、灵敏度高、省时省力且易于操作的双重PCR检测体系，所述的引物组合物可在快速检测和/或鉴定禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，设及一种用于禾谷抱囊线虫与菲利普抱囊线虫双重 PCR快速检测的引物组合物及其应用。
技术介绍
禾谷类作物抱囊线虫（cerealcystnematodes,CCN)是一类世界范围内危害小 麦、大麦、燕麦等禾谷作物的重要病原线虫，该类线虫包括异皮线虫属多种植物寄生线虫 W，其中分布最广、危害最重的主要是禾谷抱囊线虫化eteroderaarenaria)、菲利普抱囊 线虫化filipjevi)和麦类抱囊线虫化.latipons)W。 我国自1989年首次在湖北省天口县发现禾谷抱囊线虫W来迄今该病原物分 布范围已达河南、河北、山东、江苏、安徽等16个省（市）W，部分省区重病田可减产50%W 上，甚至绝收W。继禾谷抱囊线虫之后，2010年我国首次在河南省发现了菲利普抱囊线虫 ?。该线虫在俄罗斯、乌克兰、塔吉克斯坦等国家危害严重，可造成春小麦减产66%m，其发 生危害同样给我国的小麦生产带来了严重的威胁此外，在我国黄淮麦区荣阳、保定、安阳有 可能存在同一地区禾谷抱囊线虫与菲利普抱囊线虫复合发生的情况?。由于上述两种线虫 对一些小麦品种会表现出不同的抗感反应W，因此快速准确的鉴定禾谷抱囊线虫与菲利普 抱囊线虫的种类，W及明确其在田间单独或混合发生对于抗病品种的推广种植具有重要意 义。 目前，除了形态学鉴定方法之外，针对上述两种线虫的分别设计特异性引物的分 子生物学鉴定技术也有报道Μ12^，但运些已建立的方法均特异性的只针对于禾谷抱囊线虫 或菲利普抱囊线虫其中的一种，因此测定同一个未知样本时往往需要单独开展两次不同的 鉴定，增加工作量的同时对样本的量也有一定的要求。李洪连等建立了禾谷抱囊线虫或菲 利普抱囊线虫的实时巧光定量PCR检测体系Μ，但该技术的运用需要依赖于专业的定量 PCR仪器W及对探针进行巧光标记处理，成本相对较高不利于推广应用，且该专利中引物设 计祀点也与本专利技术不同，前者位于线虫rDNA基因高度保守序列5. 8S区域，而本专利技术选择两 种线虫之间遗传变异更为丰富的mtDNA-COI基因，从而确保引物具有更高的特异性。 阳0化]双重PCR(化plexPCR)能够在一个PCR反应体系里可同时检测两个不同的祀标片 段，在病原物快速鉴定中具有极大的优势。双重PCR要求在同一反应体系中同时对不同的 祀位点进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，不同引物之间是否形成二聚体、 退火溫度差、引物的配比、反应溫度等不同参数均具有较高的要求，Toumi等等尝试将分别 用于检测禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫的特异性引物混合，进行两种线虫的双重PCR检 巧。，无法达到预期的检测效果，所用引物只能单独检测各自对应的抱囊线虫W。目前国内 外尚未有利用双重PCR技术检测禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种可W同时检测禾谷抱囊线虫 和菲利普抱囊线虫的引物组合物。 本专利技术的另一目的是提供该引物组合物的应用。 本专利技术的又一目的是提供检测禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫快速检测方法。 本专利技术的目的可通过如下技术方案实现： 一种用于禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫双重PCR快速检测的引物组合物，由W 下引物组成：化F8 :沈QIDNO. 3,HfF9 :沈QIDNO. 4,化fR8:SEQIDNO. 5。 本专利技术所述的引物组合物在检测和/或鉴定禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫中 的应用。 本专利技术所述的引物组合物在制备禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫检测和/或鉴 定试剂中的应用。 一种禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫检测试剂，包含本专利技术所述的引物组合物。 一种禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫双重PCR检测方法，包括W下步骤： (1)提取待检样本DNA;(2)W提取的DNA为模板，利用本专利技术所述的引物组合物进行双重PCR扩增； (3)扩增反应结束按照W下方式观察结果： 取扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳，邸染色，在紫外灯下观测，扩增产物为 200bp条带时，表明待测样本为禾谷抱囊线虫，而扩增产物为320bp条带时为菲利普抱囊线 虫，如同时出现上述两条扩增条带，表明待测样本中同时含有禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊 线虫。 其中，步骤（2)所述双重PCR扩增的反应体系优选为25μ1，由 1)引物混合液出aF8 为 0. 24μmol/l，HfF9 为 0. 16μmol/l，HafR8 为 0. 4μmol/ L； 2)反应混合液：0. 2mmol/LdNTP，2mmol/LMgCl2，lXExTaqBuffer，5UExTaq DNA聚合酶； 阳02引 3) 1μIDNA模板； 4)灭菌双蒸馈水组成。其中各成分的浓度均表示在反应体系中的终浓度。 步骤（2)所述双重PCR扩增的反应条件优选： 阳0巧]94Γ3min;94°C30s，58Γ30s，72Γ30s，35 个循环；72Γ延伸lOmin。 有益效果： 双重PCR由于在同一反应体系中添加两条W上的引物，不同引物之间形成多种二 聚体从而影响PCR扩增效果，本专利技术通过扩增并比较不同线虫的mtDNA C0I基因序列，设计 不同的引物组合，经分析其G+C含量、二级结构、自由能等参数，最终筛选到一套特异性引 物组合，并进一步通过优化反应体系及扩增溫度，建立了能够同时检测禾谷抱囊线虫和菲 利普抱囊线虫双重PCR反应体系。[00測 （1)特异性强，不同于多数线虫特异性检测引物基于口S、28S、5. 8S等rDNA序列设 计，本专利技术WmtDNAC0I基因为扩增祀标，由于不同线虫C0I基因变异度高于rDNA区序列， 从而保证了本专利技术引物具有足够的特异性，克服了禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫长期W 来的因序列相似度高而难W进行双重PCR分子检测的技术难题。 (2)稳定性强，双重PCR体系中不同引物形成的复杂结构往往导致PCR扩增的不稳 定性，本专利技术采用分别设计禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫的特异性上游引物各一条，两 种线虫共用同一条下游引物的策略，从而减少了反应体系中不同种类引物的数量，有效的 减少了引物二聚体对扩增的影响。 (3)样本需求量小，本专利技术由于只需要通过一次PCR即可同时鉴定两种线虫，且引 物灵敏度能够达到1/2000000抱囊，1/640条禾谷抱囊线虫幼虫、1/1280菲利普抱囊线虫， 因此仅需要及少量的样本即可完成。 (4)操作简单，对设备要求低，只要将全部引物按照比例添加到统一体系中即可， 普通的PCR反应即可获得结果，不需要实时巧光定量PCR仪等高值设备。 综上所述，本专利技术具有比现有的分别针对禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫PCR鉴 定技术检测效率高，特异性强，可应用高通量的禾谷类作物抱囊线虫的检测鉴定，具有实际 的应用价值。【附图说明】 Μ:DL2000DNA标准分子量（Takara) ;1 :菲利普抱囊线虫样本；2 :禾谷抱囊线虫样 本；3 :禾谷抱囊线虫与菲利普抱囊线虫混合样本；4 :d地2〇空白对照，无扩增产物。图2为双重PCR检测方法特异性鉴定琼脂糖凝胶电泳图，Μ:DL2000DNA标准分子量灯akara) ;1 :禾谷抱囊线虫；2 :菲利普线虫；3:大麦抱 囊线虫；4 :大豆抱囊线虫；5 :南方根结线虫；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测引物组合物，其特征在于：由以下引物组成：HaF8：SEQ ID NO.3，HfF9：SEQ ID NO.4，HafR8：SEQ ID NO.5。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王暄，李红梅，牛雯雯，陈云芳，李师默，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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