分泌TRAIL的间充质干细胞及其治疗脑瘤的用途制造技术

分泌TRAIL的间充质干细胞及其治疗脑瘤的用途。本发明专利技术涉及基因重组和干细胞应用领域。具体的，本发明专利技术提供了一种用于表达分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的构建体，以及包含所述构建体的慢病毒表达载体。本发明专利技术还提供了在其基因组上整合了所述构建体的间充质干细胞，其可表达和分泌所述TRAIL蛋白片段。本发明专利技术还提供了所述构建体或载体或间充质干细胞在治疗脑瘤中的应用。

Secreted TRAIL mesenchymal stem cells and their use in the treatment of brain tumors

Secreted TRAIL mesenchymal stem cells and their use in the treatment of brain tumors. The present invention relates to gene recombination and stem cell application. Specifically, the present invention provides a construct for expressing soluble fragments of secreted TRAIL proteins and a lentiviral expression vector containing the constructs. The present invention also provides mesenchymal stem cells that integrate the constructs into their genomes, which can express and secrete the TRAIL protein fragments. The present invention also provides the application of the constructed body or vector or mesenchymal stem cells in the treatment of brain tumors.

【技术实现步骤摘要】
分泌TRAIL的间充质干细胞及其治疗脑瘤的用途
本专利技术涉及基因重组和干细胞应用领域。具体的，本专利技术提供了一种可表达分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的构建体，以及包含所述构建体的慢病毒表达载体，以及在其基因组上整合了所述构建体的干细胞，其可表达和分泌所述TRAIL蛋白片段。本专利技术还提供了所述构建体或载体或干细胞在治疗脑瘤或制备脑瘤药物中的应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TumorNecrosisFactor-RelatedApoptosis-InducingLigand,TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一员，主要通过与细胞表面的死亡受体(DR4和DR5)结合，启动外源性凋亡途径，从而诱导肿瘤细胞产生凋亡。并且，该凋亡诱导活性主要是针对肿瘤细胞，而对正常细胞不产生杀伤作用，因此具有一定肿瘤特异性。获得TRAIL蛋白最经济的方式是基因工程表达纯化，目前多用的表达系统包括大肠杆菌原核表达系统和细胞真核表达系统。由于TRAIL蛋白是哺乳动物起源，因此真核细胞表达系统具有更好的兼容性。真核细胞表达TRAIL蛋白过程中有3个问题需要解决。1.TRAIL的可分泌性：一般的真核细胞表达载体缺乏有效的分泌型信号肽序列，不能将表达的目的蛋白输送到细胞外培养基当中去，而是累积在细胞内部，一方面影响了目的蛋白的积累，另一方面也为后续分离纯化过程增加了困难。2.TRAIL蛋白的可溶性：TRAIL蛋白分子的氨基端为疏水区跨膜结构，集中大量疏水氨基酸残基，导致TRAIL蛋白水溶性很差，在溶液中易集聚成团而失去活性。3.构建的基因工程细胞基因稳定性，普通真核细胞表达载体，将目的基因片段带入宿主细胞基因组中后，并不能稳定存在，目的基因随着宿主细胞传代分裂过程会逐渐丢失，因此需要不断的抗生素选择和单克隆细胞筛选。本领域仍需要获得能够稳定和高效表达和分泌有活性的TRAIL蛋白或片段的构建体、载体和宿主细胞。本领域更需要能够用于治疗有关疾病和用于制备相关药物的能够稳定和高效表达和分泌有活性的TRAIL蛋白或片段的构建体、载体和宿主细胞。
技术实现思路
本专利技术针对以上问题，提供了在其基因组上整合了外源核酸的间充质干细胞，其可稳定和高效表达和分泌TRAIL蛋白片段。为此，本专利技术还构建了一种可表达分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的慢病毒表达载体，该载体可稳定的转染哺乳动物宿主细胞，并可将表达的TRAIL蛋白可溶性片段分泌到宿主细胞外的细胞培养液中，便于后续的收集，分离和纯化。本专利技术还提供了所述间充质干细胞在治疗TRAIL相关疾病或制备药物中的应用，这些疾病包括癌症或肿瘤，特别是脑瘤。具体的，本专利技术提供了一种分离的构建体，其中，所述构建体包含(1)分泌信号肽编码区；(2)TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区；和(3)TRAIL蛋白片段编码区，其中所述TRAIL蛋白片段具有与下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列：(a)TRAIL的114～281氨基酸残基的；(b)与(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且具有TRAIL蛋白活性。真核生物的分泌信号肽存在于待分泌或将成为跨膜部分的蛋白质上，通常位于蛋白质的N-末端。本专利技术所指的信号肽可以是异源的信号肽，即为非天然地可操作地连接于蛋白质或多肽的信号肽。信号肽的使用可以令目标蛋白质或多肽可分泌到产生其的细胞外或分泌增加。常见的信号肽包括原纤蛋白分泌信号肽、生长因子信号肽、激素信号肽、细胞因子信号肽和免疫蛋白信号肽等。信号肽的例子包括GDF信号肽、IGF信号肽、BMP信号肽、神经营养因子信号肽、PDGF信号肽和EGF信号肽、激素信号肽(例如生产激素、胰岛素、ADH、LH、FSH、ACTH、MSH、TSH)、或白细胞介素信号肽。这些信号肽多来自哺乳动物来源的，例如人、小鼠、大鼠、猪、猴等，优选的，本专利技术使用的信号肽是小鼠或人来源的。所述信号肽还可经过修饰，以增强其帮助蛋白质分泌的能力。其中本专利技术的构建体中采用的所述分泌信号肽可选自人原纤维蛋白分泌信号肽，人生长激素分泌信号肽，人免疫球蛋白信号肽，人白细胞介素2信号肽等。本专利技术优选使用的分泌信号肽为来源于人原纤维蛋白的分泌信号肽。人原纤维蛋白(humanfibrillin-1)，或人原纤蛋白，由SakaiLY,KeeneDR,EngvallE等在1986，J.CellBiol.103，“Fibrillin,anew350-kDglycoprotein,isacomponentofextracellularmicrofibrils”进行了报道。人原纤维蛋白是一种可分泌的糖蛋白，由成纤维细胞分泌到细胞外基质。人原纤维蛋白分泌信号肽具有如下氨基酸序列：MRRGRLLEIALGFTVLLASYTSHGADA。可编码人原纤维蛋白分泌信号肽的核酸序列可用于本专利技术的构建体中。本专利技术的构建体中，优选的所述分泌信号肽编码区具有SEQIDNO：2所示的序列。在本专利技术的构建体中，其中所述TRAIL蛋白三聚体稳定结构用于帮助形成稳定的TRAIL蛋白或TRAIL片段的三聚体形式。TRAIL蛋白或TRAIL片段的三聚体形式相对于单体更稳定，活性更好。本专利技术可用的三聚体稳定结构序列包括异亮氨酸拉链结构，亮氨酸拉链结构等。在本
中已知的，在多种天然蛋白中发现有亮氨酸拉链结构域或异亮氨酸拉链结构存在。亮氨酸拉链(Leucinezippers)结构是指在反式因子的一段肽链中每隔7个氨基酸残基就有一个亮氨酸残基出现，这段肽链所形成的螺旋出现一个由亮氨酸残基构成的疏水面，而另一面则是由亲水性氨基酸残基所构成的亲水面。由亮氨酸残基组成的疏水面即为亮氨酸拉链条，两个具有亮氨酸拉链条的反式因子，就能借疏水作用形成二聚体或多聚体例如三聚体。亮氨酸拉链结构域或异亮氨酸拉链结构可以相互作用形成二聚体或者三聚体。本专利技术的构建体中包含的亮氨酸拉链结构域或异亮氨酸拉链结构可以促进融合蛋白的寡聚化因而能够增加稳定性。适合的人源亮氨酸拉链结构域例如人c-fos，c-jun，c-myc，max和mdx1蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。在本专利技术中，可选择优化并且经实验证明可使得表达的TRAIL蛋白片段形成三聚体的亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链结构序列。专利技术人通过设计和测试，得到了优化的编码异亮氨酸拉链结构序列的核酸序列。本专利技术的构建体中，优选的所述TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区具有SEQIDNO：3所示的序列。在本专利技术的构建体中，其中所述TRAIL蛋白片段为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列第114-281个氨基酸的片段。本领域已知人TRAIL是由281个氨基酸组成的II型跨膜蛋白。Wiley,S.R.等在IdentificationandCharacterizationofaNewMemberoftheTNFFamilythatInducesApoptosis.Immunity3,673-682(1995)进行了报道。TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。本专利技术的构建体包含的TRAIL编码区编码的蛋白质可以是带有活性的TRAIL的片段，即具有TRAIL的281个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的构建体，其中，所述构建体包含(1)分泌信号肽编码区；(2)TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区；和(3)TRAIL蛋白片段编码区，其中所述TRAIL蛋白片段具有与下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列：(a)TRAIL的114～281氨基酸残基；(b)与(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少99％同一性，并且具有TRAIL蛋白活性。

【技术特征摘要】
2016.03.30 CN 20161019478111.一种分离的构建体，其中，所述构建体包含(1)分泌信号肽编码区；(2)TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区；和(3)TRAIL蛋白片段编码区，其中所述TRAIL蛋白片段具有与下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列：(a)TRAIL的114～281氨基酸残基；(b)与(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少99％同一性，并且具有TRAIL蛋白活性。2.权利要求1的构建体，其中所述分泌信号肽是人原纤维蛋白分泌信号肽，人生长激素分泌信号肽，人免疫球蛋白信号肽，人白细胞介素2信号肽，优选为人原纤维蛋白分泌信号肽，例如所述分泌信号肽编码区具有SEQIDNO：2所示的序列。3.权利要求1或2的构建体，其中所述TRAIL蛋白三聚体稳定结构序列是异亮氨酸拉链结构，亮氨酸拉链结构，例如所述TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区具有SEQIDNO：3所示的序列。4.权利要求1-3中任一项的构建体，其中所述TRAIL蛋白片段编码区具有SEQIDNO：1所示的序列。5.权利要求1-4中任一项的构建体，其具有SEQIDNO：4所示的序列。6.一种载体，其包含权利要求1-5中任一项的构建体，优选的，所述载体为动物细胞表达载体，优选为慢病毒载体，例如pCDH。7.一种哺乳动物细胞，其基因组上整合了权利要求1-5中任一项的构建体，并且可表...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡祥，潘伟生，路钢，徐明恺，刘沐芸，苏献伟，
申请(专利权)人：深圳市北科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44