人重组表皮生长因子MJ‑hEGF基因优化序列及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种人重组表皮生长因子MJ‑hEGF基因优化序列及其制备方法和应用，具体是通过将MJ短肽与hEGF连接制备重组人表皮生长因子，得到人重组表皮生长因子MJ‑hEGF基因优化序列，并且将此基因克隆到pET‑30a载体上，获得高表达的mj‑hEGF多肽表达工程菌，制备重组人表皮生长因子，发挥生物学活性。本发明专利技术提供的人重组表皮生长因子MJ‑hEGF基因优化序列在原核表达体系中表达量显著提高，对EGF的产业化以及今后在化妆品和生物医药领域的应用有重要意义。

Recombinant human epidermal growth factor MJ optimized hEGF gene sequence and its preparation method and Application

The present invention provides a recombinant human epidermal growth factor MJ optimized hEGF gene sequence and its preparation method and application, in particular by connecting with the hEGF MJ peptide preparation of recombinant human epidermal growth factor, recombinant human epidermal growth factor by MJ optimized hEGF gene sequence, the gene was cloned into pET 30A the carrier, MJ high expression of hEGF polypeptide engineering bacteria, preparation of recombinant human epidermal growth factor, its biological activity. The invention provides a recombinant human epidermal growth factor MJ hEGF gene sequence optimization significantly increased in prokaryotic expression system, has important significance for the industrialization of EGF and the application in cosmetics and medicine.

【技术实现步骤摘要】
人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列及其制备方法和应用。
技术介绍
EGF是继神经生长因子之后发现的第二个生长因子，1959年由Chone首先从小鼠领下腺中分离出来，因为能够促进小鼠门齿的萌出及眼睑睁开，最初被称为“齿睑因子”。随后发现这种多肽能够促进表皮生长，又将其命名为表皮生长因子(即小鼠表皮生长因子，mEGF)121。1975年Gergoyr从人尿中提取出一种具有抑制胃酸分泌的物质称为尿抑胃素(urogastrone)，后来证实尿抑胃素即人EGF(hEGF)。hEGF含有53个氨基酸残基，分子量为6200Da，沉降系数1.255，等电点pH4.7，含3个链内二硫键，是多肤生长因子中最小的一个。相对于其它多肤类物质，EGF对酸和热均较稳定，是已知的最稳定的蛋白多肽之一。hEGF系一单链多肤，圆二色谱研究表明，hEGF没有α螺旋，β片层结构占22％。在整个hEGF分子中，主要折叠为两个结构域：1-32氨基酸残基区域为N-端结构域，33-53氨基酸残基区域为C-端结构域。其中22-32残基区和33-53残基区直接参与EGF与其受体的结合，前者起信号转导作用，后者起稳定作用。MJ活性肽含有21个氨基酸，主要是非极性氨基酸，极性氨基酸比率不到20％。非极性活性区域能够稳定hEGF的表达，以及提高表达后的稳定性；加在N端，可以发挥信号肽的作用，迅速将hEGF引导至细胞表面，与EGFR受体结合。hEGF能促进烧伤、创伤及外科伤的愈合，在烧伤、创伤、皮肤和角膜移植、外伤性皮肤溃疡等治疗中有重要作用。EGF也是某些化妆品的添加剂，具有较大的市场价值。目前利用原核系统表达重组hEGF(rhEGF)的主要弊端是表达量较低，生物活性不高，真核表达周期长，操作繁琐，成本高等缺点很难规模化生产。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术的目的是解决现有原核系统表达重组hEGF(rhEGF)表达量较低、生物活性不高、操作繁琐、成本高的技术问题，提供一种人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列及其制备方法和应用。技术方案：人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列，如SEQIDNO.1所示。上述人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列的制备方法，包括以下步骤：步骤1，在基因数据库中获取人表皮生长因子hEGF基因；步骤2，基因优化：对人表皮生长因子hEGF基因的编码区进行大肠杆菌密码子偏爱性的基因优化得到优化序列，如SEQIDNO.2所示，优化序列编码的氨基酸与人表皮生长因子hEGF基因编码形成的氨基酸序列一致；步骤3，基因重组：将优化序列与MJ活性肽核苷酸序列，如SEQIDNO.3所示，进行重组，得到人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列；步骤4，添加酶切位点：在人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列的5’端添加一种内切酶的酶切位点，在重组序列的3’端添加另一种内切酶酶切位点，得到合成序列；步骤5，基因合成：对得到的合成序列进行全基因合成。进一步地，在步骤3中，重组序列的5’端添加NdeI酶切位点，重组序列的3’端添加XhoI酶切位点。含有上述人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列的质粒。进一步地，所述质粒为pET-30a质粒。进一步地，上述人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列插入到pET-30a质粒的NdeI酶切位点和XhoI酶切位点之间。含有上述人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列的原核生物。进一步地，所述原核生物为大肠杆菌。上述人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列表达得到的人表皮生长因子hEGF在制备护肤品中的应用。有益效果：利用本专利技术的人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列可实现原核细菌宿主工程菌EGF蛋白的高表达，并且具有较高的生物学活性：1、其表达量约占总蛋白的30％左右，以包涵体的形式表达，复性成功的前体下包涵体处理相对较容易；2、通过纯化后，得到纯度在95％左右的EGF小肽，并且依据中国药典2010版中的重组人表皮生长因子生物学活性测定方法，检测了生物学活性，活性大于药典标准1×105UI。附图说明图1为实施例2中含人重组MJ-hEGF重组载体酶切鉴定琼脂糖凝胶图；图2为实施例2中人重组MJ-hEGF蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；图3为实施例3中人重组MJ-hEGF蛋白的MTT细胞活性吸光度检测结果。具体实施方式下面通过具体实施方式对专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例1人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因制备方法登录GeneBank，查找人表皮生长因子hEGF活性肽的基因序列，其核酸长度为159bp，hEGF为真核生物多肽序列，考虑到后续研发在原核中进行表达，因此将上述hEGF真核多肽序列的编码密码子与大肠杆菌偏好性密码子进行比较分析。根据密码子的兼并性和不改变hEGF活性肽氨基酸排列顺序不变的情况下，参照生物软件VectorNTISuitor7.0对hEGF核酸序列进行分析，对已知的hEGF进行基因改造优化，主要是将hEGF原基因序列中大肠杆菌稀有的密码子改成偏好的密码子，以提高目的基因在大肠杆菌的高水平表达。并进行转基因验证，最终得到hEGF基因的优化序列如SEQIDNO.2所示。根据密码子的兼并性和不改变hEGF活性肽氨基酸排列顺序不变的情况下，参照生物软件VectorNTISuitor7.0对hEGF基因的优化序列进行基因改造重组，主要是将MJ的基因序列(SEQIDNO.3所示)与人表皮生长因子hEGF基因的优化序列重组，以提高目的基因在大肠杆菌的高水平表达及表达后的活性。并进行转基因验证，最终得到hEGF基因的重组序列MJ-hEGF，如SEQIDNO.1所示。将人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列N端和C端分别加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点。送上海生工公司进行全基因合成，并连入原核表达载体pET-30a(军事医学科学院馈赠)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组的原核表达质粒pET-30a-MJ-hEGF。实施例22.1表达菌株的获得将实施例1中的得到的原核表达载体pET-30a-MJ-hEGF通过热激法转入大肠杆菌BL21(DE3)(购自于天根生物公司)中，LB平板培养基中加入卡那霉素50ug/mL进行筛选，挑选单克隆酶切鉴定后(如图1所示)，进行测序进一步确认鉴定。2.2人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列的诱导表达将重组阳性单克隆菌落接种到含有浓度为50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，按照1％的比例将过夜培养的菌液接种到含有50ug/mL卡那霉素的新鲜的液体培养基中，37℃，220rpm培养至菌液浓度OD600约为0.9，立即加入诱导剂IPTG至0.5Mm,将诱导组和对照组继续培养3h，12000rpm，离心10min收集菌体。2.3人重组表皮生长因子MJ-hEGF提取与鉴定将离心收集的菌体，按照每克菌体湿重加入10mL的PBS缓冲液重选菌体，充分混匀，用终浓度为1mg/mL的溶菌酶溶液4℃过本文档来自技高网...

【技术保护点】
人重组表皮生长因子MJ‑hEGF基因优化序列，其特征在于：所述序列如SEQIDNO.1所示。

【技术特征摘要】
1.人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列，其特征在于：所述序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，在基因数据库中获取人表皮生长因子hEGF基因；步骤2，基因优化：对人表皮生长因子hEGF基因的编码区进行大肠杆菌密码子偏爱性的基因优化得到优化序列，如SEQIDNO.2所示，优化序列编码的氨基酸与人表皮生长因子hEGF基因编码形成的氨基酸序列一致；步骤3，基因重组：将优化序列与MJ活性肽核苷酸序列，如SEQIDNO.3所示，进行重组，得到人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列；步骤4，添加酶切位点：在人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列的5’端添加一种内切酶的酶切位点，在重组序列的3’端添加另一种内切酶酶切位点，得到合成序列；步骤5，基因合成：对得到的合成序列进行全基因合成。3.根据权利要求2所述的人重组表皮生长因子MJ-hEGF基因优化序列的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：张超，冷晓燕，徐燕，段云飞，常菁，虞强，
申请(专利权)人：江苏迈健生物科技发展股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32